Этот протокол важен тем, что демонстрирует, как приготовить полимерные наночастицы, инкапсулированные нуклеиновые кислоты за один простой шаг. Основными преимуществами данной методики, являются универсальность, так как ее можно применять к различным нуклеиновым кислотам и типам клеток. Использование простых процедур получения частиц, таких как пипетка вверх и вниз, и возможность продления стабильности наночастиц и условий барабана путем лиофилизации.
Продемонстрировать процедуру будут Лаура Ольмо, Корал Гарсия-Фернандес, Мария Стампа Лопес-Пинто и Мария Навалон-Лопес, аспирант нашей лаборатории и Марта Диас-Кабальеро, постдок нашей лаборатории. Для образования полиплексов разморозьте ранее подготовленные полимеры, пептид С6, полибета-аминоэфиры и вихревой раствор. После пипетирования полимерной смеси вверх и вниз готовят 12,5 миллимолярный раствор в ацетате натрия.
Вихрьте раствор и подождите 10 минут. Далее готовят мРНК по 0,5 миллиграмма на миллилитр и смешивают путем пипетирования. Снова вихрьте раствор полимера, затем смешайте раствор генетического материала в растворе полимера в соотношении один к одному в микроцентрифужной трубке и инкубируйте трубку при 25 градусах Цельсия в течение 30 минут в термоблоке.
После инкубации осадите смесь с одной-двумя водами, свободными от РНКазы, добавив образец в микроцентрифужную трубку, содержащую воду, затем, чтобы включить эксципиенты, добавляют 20 миллимолярных куч и 4% раствор сахарозы в том же объеме, что и смесь мРНК и полибета-аминоэфиров, и смешивают путем пипетирования. Для лиофилизации после замораживания полиплексного раствора при минус 80 градусах Цельсия в течение одного часа выполняют первичную сушку, затем сразу же хранят полиплексы при минус 20 градусах Цельсия во избежание регидратации. Для полиплексной ресуспензии удалите лиофилизированные наночастицы из морозильной камеры минус 20 градусов Цельсия и быстро добавьте соответствующее количество глубокой гидрогенизированной воды для повторного диспергирования твердого вещества и достижения желаемой концентрации.
Пипетку осторожно до полного повторного суспендирования и после растворения пипетку вверх и вниз энергично избегая пузырьков. После 24 часов трансфекции для качественной оценки с помощью флуоресцентной микроскопии поместите на микроскоп пластину 96 лунок, содержащую трансфектированные клетки Hela, и начните визуализацию с использованием 10-кратного объектива. Сначала примените баланс белого, чтобы создать фоновую ссылку для программного обеспечения, а затем получите изображение, чтобы наложить его на флуоресцентное изображение во время анализа.
Измените режим микроскопа на режим отражения и переместите колесо фильтра на синий лазер для визуализации EGFP. Затем получите изображения для всех условий или скважин, используя одинаковое время экспозиции. Для количественной оценки с помощью проточной цитометрии промыть клетки Hela, трансфектированные в 96-луночной пластине, используя 100 микролитров PBS на скважину.
После аспирации PBS по 25 микролитров трипсина на лунку и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Как только клетки отсоединяются, добавьте ранее восстановленную среду для инактивации трипсина, затем зафиксируйте клетки, добавив 31,25 микролитра 10% формалина на лунку и инкубируя в течение 20 минут. Затем включите проточный цитометр и программное обеспечение, затем установите надлежащие условия для эксперимента, включая тип объема образца пластины и другие параметры, такие как встряхивание и промывка между образцами.
Настройте соответствующие параметры для количественной оценки процента положительно трансфектированных клеток, сначала просматривая данные о потоке прямого рассеянного света по сравнению с боковым рассеянным светом, чтобы отличить клетки от обломков. А затем построить еще один диаграмму рассеяния, сравнивая амплитуду с высотой с затвором и различая отдельные клетки. За сутки до трансфекции пластину 10 000 клеток JAWS II на лунку в 96 луночной пластине для ночной инкубации.
На следующий день трансфектируют клетки с 0,6 мкг мРНК на лунку и инкубируют пластину в течение 24 часов в сухом воздушном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день промыть оставшиеся в лунке клетки 25 микролитрами PBS. После аспирации PBS в 25 микролитров трипсина и инкубации пластины в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия для отделения клеток.
Остановите реакцию трипсина, добавив на корреспондент ранее восстановленные носители. Затем центрифугируют пластину, аспирируют среду и фиксируют клетки, добавляя 50 микролитров PBS и 2,5% формалина на лунку с последующим инкубацией пластины при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут, центрифугируют пластину. Затем добавьте 50 микролитров PBS и 3% BSA на лунку и инкубатор в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
После инкубации центрифугируют пластину снова, затем добавляют 50 микролитров мышиного овальбуминового антитела в PBS и 3%BSA и инкубатор в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Повторите этап центрифугирования, затем промыть клетки 50 микролитрами PBS. После аспирации PBS добавьте вторичные антитела и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.
После инкубации повторите этапы центрифугирования и промывки. Затем повторно суспендируют клетки и 100 микролитров PBS и 2,5% формалина для анализа проточной цитометрии. Физико-химические характеристики свежих и лиофилизированных наночастиц, инкапсулирующих мРНК GFP, не показывают существенных различий в размерах и индексе полидисперсности.
Просвечивающая электронная микроскопия полиплексов подтверждает образование сферических и монодисперсных наночастиц диаметром около 50 нанометров. Данные об эффективности инкапсуляции пептида Lego и модифицированных полибета-аминоэфирных полиплексов, инкапсулирующих GFP, или овальбумина, не показывают существенных различий в зависимости от типа мРНК. Здесь показан качественный анализ экспрессии EGFP через 24 часа после транзакции в клеточной линии JAWS II.
Количественно по сравнению с отрицательным контролем. Процент положительных клеток GFP значительно выше и сопоставим с положительным контролем, выполненным с помощью классического трансфекционного реагента. Олигопептид, нагруженный мРНК овальбумина, и модифицированные наночастицы полибета-аминоэфира могут активировать дендритные клетки, о чем свидетельствует значительно более высокая экспрессия мембранных маркеров CD11b и CD86 в трансфектированных клетках по сравнению с нетрансфектированными клетками.
Наша платформа вакцинации, основанная на использовании мРНК в качестве активного принципа, а также наших запатентованных полимеров может быть адаптирована для использования в профилактике, а также для лечения рака. Мы можем использовать нашу технологию, чтобы подчеркнуть этот вклад в иммунотерапевтическое лечение рака. поскольку мы можем инкапсулировать опухолеассоциированные антигены в наших наночастицах и сделать сдвиг в лечении рака.
