Оценка L-DOPA-индуцированных дискинезий в 6-гидроксидофаминовой крысиной модели болезни Паркинсона является важным доклиническим инструментом для выявления эффективных антидискинетических вмешательств. Эта модель относительно проста, отличается низкой стоимостью и имеет сходство с тем, что происходит в клинике. Процедуру продемонстрирует Данило Леандро Рибейро, аспирант лаборатории.
Начните эксперимент с самцами крыс Sprague-Dawley, весом от 200 до 250 граммов. Разводят по два-три животных в клетке в стандартных лабораторных условиях с пищей и водой, доступными ad libitum. Перед операцией введите ингибитор переносчика норадреналина, имипрамин, крысе внутрибрюшинно.
После подтверждения анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги расположите крысу в положении лежа в стереотаксическом аппарате поверх грелки. Как только крыса будет позиционирована, используйте скальпель, чтобы сделать разрез длиной в один сантиметр в области, где произойдет микроинъекция. Затем очистите область черепа ватными тампонами и убедитесь, что брегма и лямбда обнажены.
Возьмем медиальный пучок переднего мозга, или MFB, стереотаксические координаты от брегмы в 4,3 миллиметра спереди, 1,6 миллиметра сбоку с правой стороны и 8,3 миллиметра вентрально от дурометра. Когда координаты определены, вводите 6-гидроксидофамин, или 6-OHDA, в одностороннем порядке со скоростью 0,4 микролитра в минуту в правом MFB, с 50-микролитровым стеклянным шприцем Гамильтона. В конце операции зашить разрез кожи головы и регидратировать животное теплым, стерильным, 0,9% физиологическим раствором подкожно, в дозе 10 миллилитров на килограмм.
Извлеките животное из стереотаксической рамки и поместите его в теплую клетку для восстановления, наблюдая за восстановлением сознания. Через четыре недели после поражения измеряют эффективность дофаминергического поражения с помощью степпинг-теста, оценивая акинезию передней конечности контралатерально к поражению. Крысы, представляющие три или менее корректирующих шагов с контралатеральной передней конечностью, должны быть включены в исследование как предполагаемые, сильно пораженные 6-OHDA крысы.
Через четыре недели после поражения 6-OHDA начните хроническое лечение в понедельник и зафиксируйте аномальные непроизвольные движения в среду. Для этого поместите крысу внутрь прозрачного цилиндра диаметром 20 сантиметров и высотой 40 сантиметров, и дайте ей акклиматизироваться не менее 15 минут. Убедитесь, что пол покрыт материалом подстилки, а зеркала расположены за цилиндром, чтобы наблюдать за животным со всех возможных углов.
Расположите видеокамеру с высоким разрешением, чтобы обеспечить просмотр осевых, конечностных и оролингвальных аномальных непроизвольных движений. Зеркала за цилиндром позволят отслеживать аномальные непроизвольные движения под углом 360 градусов. Камера может быть расположена немного ниже плоскости под углом 15 градусов от животных, чтобы наблюдать оролингвальные аномальные непроизвольные движения.
Когда положение определено, закрепите камеру прямо на скамейке. После того, как животное акклиматизируется в течение 15 минут, выньте животное из цилиндра и введите пять миллиграммов на килограмм свежеприготовленного L-дофамина или L-ДОФА в сочетании с 12,5 миллиграммами на килограмм бенсеразида подкожно. Поместите животное обратно в цилиндр и запустите таймер для отслеживания ненормальных непроизвольных движений.
Используйте видеокамеру для записи аномальных непроизвольных движений в течение 180 минут после инъекции, с 30-минутными интервалами, чтобы проводить офлайн-подсчет очков. После шести периодов наблюдения оценки должны быть даны в течение одной-двух минут эпох и классифицированы как осевые, конечностные или оролингвальные. Убедитесь, что вы не включаете нормальное поведение.
Лечение L-ДОФА и бенсеразидом следует продолжать в течение трех недель, один раз в день, с понедельника по пятницу. В репрезентативном анализе временного курса показаны баллы, примененные к осевым, конечностным и оролингвальным аномальным непроизвольным движениям в течение трех недель хронического приема L-DOPA. Было отмечено, что дискинезии, вызванные L-DOPA, пиковые дозы возникают между 30 и 90 минутами, с постепенным снижением через 120 минут после инъекции.
Кроме того, сумма осевых, конечностных и оролингвальных аномальных непроизвольных движений была представлена на людях, набравших дней и еженедельно в течение трех недель хронического приема L-DOPA. Протокол аномальных непроизвольных движений обычно предназначен для исследования новых терапевтических инструментов с антидискинетическим трансляционным потенциалом.
