Надежный анализ считывателя пластин, подобный нашему, очень полезен для первоначального скрининга потенциальных ингибиторов метилтрансферазы. Возможность сбора данных в режиме реального времени является большим преимуществом непрерывного эндонуклеазно-связанного анализа. Начните с подготовки 600 микролитров условий анализа, содержащих 20 микромолярных и 50 микромолярных соединений, отдельно в микроцентрифужных трубках на льду.
Для этого добавьте двойную дистиллированную воду и 5-кратный буфер метилирования в каждую трубку для достижения конечной концентрации 1X буфера метилирования. Затем добавьте 3,15 микролитра по 20 миллиграммов на миллилитр бычьего сывороточного белка, или BSA, к каждому образцу. Затем добавьте два микролитра 3,15 микромолярного субстрата ДНК шпильки и 1,33 микролитра 4,75 микромолярного S-аденозилметионина, или SAM, к каждому образцу.
Добавьте ингибитор к соответствующим образцам для достижения конечной концентрации 21 микромолярного или 52,5 микромолярного и эквивалентного количества диметилсульфоксида или ДМСО в контрольный образец перед смешиванием растворов путем вихря со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение трех секунд. Затем вращайте образцы в течение нескольких секунд в столовой мини-центрифуге в 1, 200 раз G, чтобы убедиться, что раствор собран в нижней части трубки. Aliquot 95 микролитров каждого пробирного раствора в шесть последовательных скважин в черной половине площади 96 луночной пластины.
Приготовьте 75 микролитров раствора фермента Gla I или DNMT1 плюс Gla I в микроцентрифужных трубках, как описано ранее, до конечной концентрации одноразового буфера. Затем добавьте 1,2 микролитра по 10 единиц на микролитр Gla I к каждому раствору для достижения конечной концентрации 0,16 единицы на микролитр. Добавьте 0,6 микролитра пяти микромоляров DNMT1 без RFTS в раствор DNMT1 плюс Gla I для окончательной концентрации 40 наномоляров.
После тщательного перемешивания вращайте образцы в течение нескольких секунд в настольной мини-центрифуге при 1 200 г, чтобы убедиться, что раствор собран в нижней части трубки. Затем аликвотирование 12 микролитров каждого раствора фермента в шесть лунок в коническом дне 96 лунок. Для анализа метилирования образца ДНК предварительно разогрейте считыватель пластин до 37 градусов по Цельсию.
Затем вставьте черную пластину, содержащую растворы для анализа, в считыватель пластин. После встряхивания пластины при 425 CPM измерьте флуоресценцию с длиной волны возбуждения 485 нанометров и длиной волны излучения 528 нанометров. Затем высиживают пластину при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Снимите пробирную пластину со считывателя пластин и добавьте пять микролитров раствора фермента в каждую лунку, после чего перемешайте раствор путем пипетки вверх и вниз. Вставьте пластину в считыватель пластин и встряхните пластину перед записью флуоресценции каждые 53 секунды в течение 30 минут. Получите среднюю флуоресценцию тройных контрольных анализов Gla I для каждого состояния и вычтите средний Gla I, содержащий контрольные реакционные лотки, из тройных следов, полученных в присутствии RFTS-отсутствующего DNMT1.
Затем определите среднюю и стандартную погрешность среднего значения для исправленных реплик. Постройте среднюю скорректированную след реакции и поднесите начальную линейную часть к линии, чтобы определить начальную скорость. Определить процент активности, разделив скорость, наблюдаемую в присутствии соединения, на скорость, наблюдаемую в ДМСО, содержащем управляющую реакцию, и умножив на 100.
Результаты прерывистого эндонуклеазно-связанного анализа показали, что ДНК полностью метилированного продукта защищена от расщепления, подтверждая, что RFTS-отсутствующий DNMT1 активен и способен метилировать ДНК гемиметилированного субстрата. В флуоресцентном анализе, в отсутствие Gla I, добавление DNMT1 или буфера само по себе не влияло на фоновую флуоресценцию. Последующее добавление Gla I ко всем анализам привело к генерации флуоресценции только в анализах, которые содержали DNMT1.
Одновременное добавление RFTS-отсутствующих DNMT1 и Gla I к трем анализам привело к надежной генерации флуоресценции. Добавление Gla I само по себе не произвело флуоресценции. Для скрининга потенциальных ингибиторов активность метилирования ДНК RFTS-отсутствующего DNMT1 исследовали в присутствии DMSO, соединения один, соединения два или соединения три при 20 и 50 микромолярных концентрациях.
Соединения, которые уменьшают генерацию флуоресценции в этом связанном анализе, должны быть дополнительно проверены. Обеспечение того, чтобы соединения не ингибировали фермент связи, является важным следующим шагом.
