Таким образом, анализ генома метилирования ДНК с помощью платформы LA для комплексной аберрации метилирования ДНК в геноме человека может предоставить важную информацию эпигенетических биомаркеров при раке желудочно-кишечного тракта. Хотя эта платформа LA для сложной аберрации метилирования ДНК в геноме человека, она является оптимальной с точки зрения стоимости и геномного охвата. Таким образом, демонстрируя процедуру будет Хиротака Momose, аспирант из моей лаборатории.
Для начала подготовьте 10 микрометров незапачканных формальных парафиновых встроенных секций. Поместите слайды в стеклянный держатель слайда и заполните его солевым раствором, убедившись, что все ткани на слайде погружены. Оставьте горки в ксилене на 15 минут, затем вылейте ксилен, удерживая горки кончиком пипетки, чтобы они не выпадают.
Налейте больше ксилена до того же уровня, что и раньше, и повторите инкубацию. Вылейте ксилен и заполните держатель слайда 100% этанолом, убедившись, что все ткани на слайде полностью погружены. Оставьте горки в этаноле на три минуты, затем замените этанол свежим этанолом и дайте им инкубировать еще две минуты.
Слейте этанол и удалите слайды. Аккуратно поместите их лицом вверх на чистое бумажное полотенце и дайте им высохнуть в течение 10 минут. Заполните 1,5 миллилитров однополитовой полипропиленой трубки с 80 микролитров буфера лиза и положить чистый кончик пипетки в буфер.
Определите раковые ткани области опухоли, наиболее подходящей для макродиссекции в соответствии с соответствующим отделом окрашенных H и E, а затем макродисцирировать раковую ткань на основе отмеченного раздела. Возьмите чистое лезвие бритвы и аккуратно соскребать раковую ткань с слайда, пытаясь сохранить его в один кусок. Используйте наконечник пипетки для передачи выскобленой ткани в буферный флакон лиза.
Повторите этот процесс с остальными слайдами. После того, как все ткани находится в трубке, используйте наконечник, чтобы убедиться, что ткань была полностью погружена и не прилипла к стене. Добавьте 20 микролитров субтилизина, связанных с серином протеазы на флакон и осторожно Флик, чтобы смешать.
Поместите флакон в тепловой блок 55 градусов по Цельсию, по крайней мере четыре часа или на ночь, убедившись, что немного вихрь через два часа. Выполните лечение бисульфитом на 45 микролитров переваренной ткани с помощью комплекта преобразования бисульфита в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте пять микролитров буфера разбавления в образец и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут.
Между тем, подготовить бисульфит преобразования реагента, добавив 750 микролитров дистиллированной воды и 210 микролитров разбавления буфера в одну трубку реагента преобразования КТ. Смешайте трубки вихрем в течение 10 минут, затем добавьте 100 микролитров подготовленного реагента преобразования КТ в каждый образец и смешайте с помощью инверсии. Инкубировать образцы в темноте при 50 градусах по Цельсию в течение 12 до 16 часов.
После инкубации поместите образцы на лед на 10 минут. Добавьте 400 микролитров связывающего буфера и смешайте каждый образец, трубя вверх и вниз. Загрузите каждый образец в колонку спина и поместите столбец в двухми миллилитровую трубку сбора.
Центрифуга образцов на полной скорости в течение одной минуты и отказаться от потока через. Добавьте 200 микролитров буфера стирки к каждой колонке и вращайте на полной скорости в течение одной минуты, а затем отбросьте протеку. Добавьте 200 микролитров буфера десулфонизации к каждой колонке и позвольте столбцам стоять при комнатной температуре в течение 15 минут.
После инкубации, спина столбцы на полной скорости в течение одной минуты и отказаться от потока через. Вымойте колонку дважды с 200 микролитров мыть буфер центрифугирования в течение одной минуты на полной скорости после каждой стирки. Добавьте 46 микролитров дистиллированной воды к каждой колонке и поместите его в новую стерильную однополольную полипропиленую трубку на 1,5 миллилитра.
Спин трубки в течение двух минут, чтобы elute ДНК и отказаться от колонки. ДНК готова к анализу. Используйте бисульфит модифицированной ДНК в качестве шаблона для количественного метилирования конкретных ПЦР для оценки метилирования региона промоутер в каждом анализе генов.
Объедините реагенты, описанные в текстовой рукописи, и используйте 96-ну инструмент ПЦР в режиме реального времени для запуска протокола термодергового цикла. Здесь показаны характеристики 48 пациентов с раком желудка в учебной когорте. Средний возраст пациентов составил 74 года, а в когорту входили 38 мужчин и 10 женщин.
Во-первых, все 48 образцов были загружены для идентификации выбросов. Два образца дали пики, которые были больше, чем два стандартных отклонения смещены от других, и эти образцы были удалены. В результате тепловая карта была разделена на две группы на основе высокого и низкого метилирования.
Эта тепловая карта позволяет визуализировать 50 лучших зондов в пределах 1500 базовых пар транскрипционные стартовые площадки в дифференциальном анализе метилирования. Тип рака и наличие метастазов лимфатических узлов стали значительными независимыми прогностический фактор, когда клинические патологические факторы были использованы в качестве ковариатов в многовариантном анализе. Наконец, было установлено, что ген EPB41L3 тесно связан с кодификацией учебной когорты в группы с высоким и низким содержанием метилирования в анализе микроаррей.
Результаты микроаррейного анализа EPB41L3 в испытательной когорте были подтверждены количественным ПЦР, специфичным для метилирования. RMVs EPB41L3 в тканях PGC были значительно выше, чем у остатков рака желудка в унивариатном анализе. Аналогичным образом, RMVs в образцах с метастазами лимфатических узлов были значительно выше, чем те, без метастазов лимфатических узлов.
Таким образом, идентификация на раковой ткани наиболее подходит для макродиссеции в соответствии с соответствующими Н И Е окрашенных разделе требуется для успешного выполнения этого протокола.
