Существует более 100 различных модификаций РНК, две трети из которых являются метилированиями. Этот протокол обеспечивает метод для чувствительного и точного анализа деятельности писателя метилирования РНК. Этот простой в использовании метод позволяет количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам.
Демонстрацией процедуры будет Саманта Шелтон, аспирантка из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, установите 100-микролитр РНК метилтрансферазы анализ в 1,5-миллилитровой трубки на льду, как указано в текстовом протоколе. Vortex трубки тщательно перемешать, и центрифуга в 200 раз г в течение пяти секунд, чтобы собрать раствор в нижней части трубки.
Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Затем очистите реакцию с помощью очистки столбца, как указано в текстовом протоколе. Для выполнения подсчета жидких сцинтилляций найте стойку подсчета сцинтилляции одним флаконом на образец, одним флаконом для фонового измерения и одним флаконом для теста салфетки.
Заполните флаконы пятью миллилитров раствора для подсчета сцинтилляции. Добавьте 10 микролитров каждого элеватора радиоактивного образца РНК в один флакон. Затяните крышку и аккуратно перемешайте.
Чтобы подготовить пробные флаконы, тщательно протирать ватные тампоны на всех поверхностях и оборудовании, используемом во время процедуры. Добавьте эти тампоны во флаконы, наполненные раствором сцинтилляции, и затяните крышку. Для запуска образцов на счетчике сцинтилляции откройте капот счетчика, вставьте стойку в машину и закройте капот.
Выберите граф одноместный стойку. Выберите программу выбора пользователя. Выберите или создайте программу, которая измеряет тритий в течение 60 секунд, и ударил граф Стойка.
Повторите количество сцинтилляции три раза. После этого подготовь и повторно запустите денатурированный полиакриламидный гель мочевины, как указано в текстовом протоколе. Перенесите 20 микролитров радиоактивного РНК-материала в новую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 20 микролитров буфера загрузки 2X геля.
После подготовки лестницы, инкубировать образцы при 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Вымойте колодцы геля еще раз непосредственно перед загрузкой образца путем трубопроводного буфера из гелеобразуемых резервуаров вниз в колодцы геля. Затем загрузите 20 микролитров подготовленной лестницы, 20 микролитров образцов и 20 микролитров буфера загрузки геля в полосы движения геля.
Вы запустите гель на 100 вольт в течение 60 до 180 минут, в зависимости от процента полиакриламинида. После того, как гель закончил работать, удалить гель из кассеты и поместить его в коробку, содержащую 50 миллилитров буфера 1X TBE с пятью микролитров сверхчувствительных нуклеиновых кислот гель пятно. Инкубировать на рокер в течение пяти минут, чтобы испачкать РНК.
После этого осторожно вывихите гель из коробки и поместите его на УФ-трансиллюминатор системы визуализации геля с колодцами вверх и лестницей слева. Сосредоточьте камеру на геле, включите ультрафиолетовый свет и сделайе снимок геля. Затем выключите УФ-облучение и сохраните изображение в качестве файла TIFF.
Поместите гель обратно в коробку, удалите TBE, и исправить гель с 50 миллилитров фиксации раствора на рокер при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем аккуратно переместите гель в свежий черный ящик, содержащий 25 миллилитров раствора для повышения ауторадиографии. Инкубировать на рокер при комнатной температуре в течение 30 минут.
Аккуратно поднимите гель и поместите его лицом вниз на лист полиэтиленовой пленки с колодцами вверх и лестницей на правой стороне. Поместите два листа хроматографической бумаги на заднюю часть геля и переверните весь стек. Предварительно разогреть фен до 80 градусов по Цельсию.
Перемести пластиковую крышку на фен обратно. Вставьте весь стек под пластиковую крышку, и переместить пластиковую крышку обратно вниз, чтобы создать уплотнение. Высушите гель при 80 градусах по Цельсию в течение одного часа.
Затем выключите фен и аккуратно удалите стек. Снимите обертку и вторую хроматографическую бумагу. Лента оставшейся хроматографической бумаги с сушеным гелем в авториадиограмме кассеты.
В темной комнате добавьте один лист авторадиографической пленки. Храните кассету при отрицательных 80 градусах по Цельсию и развивайте пленку в соответствующее время, в зависимости от интенсивности сигнала. После того, как пленка разработана, поместите его на верхней части кассеты и использовать лабораторный маркер, чтобы тщательно отметить четыре края геля, каждый хорошо, и положение XC и BB красителей.
Сканируйте пленку с разрешением 300 или 600 пикселей на дюйм и сохраните изображение в качестве файла TIFF. В этом исследовании, без антител анализ продемонстрирован для анализа активности РНК метилтрансферазы. Типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой T7 РНК небольшой ядерной РНК 7SK показывает относительно короткую и высоко структурированную РНК.
Есть несколько нежелательных полос, как короче, так и дольше, чем 7SK, вероятно, в результате случайных транскрипционных событий инициации или прекращения. Из-за этого, гель очистки после реакции транскрипции in vitro важно получить чистый образец РНК. На этом этапе РНК, представляющие интерес, может быть идентифицирована по своему расположению относительно лестницы и очищена путем очистки геля.
Здесь показан репрезентативный анализ РНК метилтрансферазы с использованием нижнего предела рекомендуемой концентрации РНК и белка. Этот анализ позволяет как количественные результаты от сцинтилляции рассчитывает, а также качественные результаты от авторадиограммы. Здесь, РНК метилтрансферазы, как известно, метилат 7SK показано, что в состоянии также метилировать U6. Кроме того, как недавно показано на 7SK, связывание гистона H4 с MePCE также препятствует метилированию U6.
Это можно наблюдать как при подсчете сцинтилляции, так и в авторадиограмме, демонстрируя надежность этого протокола. РНК подвержена деградации, поэтому, пожалуйста, убедитесь, что использовать RNase свободных реагентов и тщательно очистить все поверхности и оборудование. Радиоактивно помеченная РНК, полученная из анализа метилтрансферазы, может быть непосредственно использована для оценки активности РНК-деметилазы или активности связывания РНК с помощью анализа электрофоретической смены подвижности, например.
Этот метод позволяет исследователям проверить влияние различных факторов на активность РНК метилтрансферазы, включая точечные мутации и лечение ингибиторами малых молекул. Этот метод использует радиоактивный материал, поэтому не забудьте носить соответствующие СИЗ, и быть осторожным во время обработки и утилизации радиоактивных материалов.
