당사와 같은 강력한 플레이트 리더 분석은 잠재적인 메틸트랜스퍼라제 억제제의 초기 스크리닝에 매우 유용합니다. 실시간으로 데이터를 수집하는 능력은 연속 엔도뉴클레아제-결합 분석의 큰 장점이다. 먼저 얼음 위의 마이크로원심분리 튜브에 20마이크로몰 및 50마이크로몰 화합물을 별도로 포함하는 600마이크로리터의 분석 조건을 준비합니다.
이렇게 하려면 각 튜브에 이중 증류수와 5X 메틸화 버퍼를 추가하여 1X 메틸화 버퍼의 최종 농도를 달성합니다. 다음으로, 3.15 마이크로 리터의 밀리리터 소 혈청 알부민 또는 BSA를 각 샘플에 밀리리터 당 20 밀리그램 첨가하십시오. 그런 다음 2마이크로리터의 3.15마이크로몰 헤어핀 DNA 기질과 1.33마이크로리터의 4.75마이크로몰 S-아데노실메티오닌 또는 SAM을 각 샘플에 추가합니다.
억제제를 적절한 샘플에 첨가하여 21 마이크로 몰 또는 52.5 마이크로 몰의 최종 농도와 동등한 양의 디메틸 설폭 시드 또는 DMSO를 대조군 샘플에 첨가 한 후 3 초 동안 분당 3, 000 회전으로 와동하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 테이블 테이블 미니 원심 분리기에서 1, 200 배 G에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록합니다. 각 분석 용액 95 마이크로리터를 검정 반쪽 영역 96 웰 플레이트에서 6개의 연속적인 웰로 분취한다.
75 마이크로 리터의 Gla I 또는 DNMT1 플러스 Gla I 효소 용액을 1 회 완충액의 최종 농도로 앞에서 설명한 바와 같이 마이크로 원심 분리 튜브에 준비합니다. 다음으로, 마이크로 리터 당 10 단위의 1.2 마이크로 리터 Gla I을 각 용액에 첨가하여 마이크로 리터당 0.16 단위의 최종 농도를 달성한다. 0.6 마이크로 리터의 5 마이크로 몰 RFTS 결핍 DNMT1을 DNMT1과 Gla I 용액에 추가하여 최종 농도 40 나노 몰을 만듭니다.
부드럽게 혼합 한 후 탁상 미니 원심 분리기에서 1, 200G의 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록합니다. 이어서, 각 효소 용액 12 마이크로리터를 원뿔형 바닥의 96웰 플레이트에서 6개의 웰로 분취한다. DNA 샘플의 메틸화 분석을 위해 플레이트 리더를 섭씨 37도로 예열합니다.
그런 다음 분석 용액이 포함된 검은색 플레이트를 플레이트 판독기에 삽입합니다. 플레이트를 425 CPM에서 진탕한 후, 485 나노미터의 여기 파장 및 528 나노미터의 방출 파장으로 형광을 측정한다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.
플레이트 판독기에서 분석 플레이트를 제거하고 각 웰에 5마이크로리터의 효소 용액을 추가한 다음, 위아래로 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 삽입하고 플레이트를 흔든 후 30분 동안 53초마다 형광을 기록합니다. 각 조건에 대한 삼중 Gla I 대조 분석의 평균 형광을 얻고 RFTS가 결여된 DNMT1의 존재 하에 수득된 삼중 트레이스로부터 대조군 반응 트레이를 함유하는 평균 Gla I을 뺀다.
그런 다음 수정된 반복실험에 대한 평균의 평균 및 표준 오차를 확인합니다. 보정된 평균 반응 트레이스를 플로팅하고 초기 선형 부분을 선에 피팅하여 초기 속도를 결정합니다. 화합물의 존재 하에서 관찰된 속도를 DMSO 함유 대조 반응에서 관찰된 속도로 나누고 100을 곱하여 활성 백분율을 결정합니다.
불연속 엔도뉴클레아제 결합 분석의 결과는 완전히 메틸화된 생성물 DNA가 절단으로부터 보호되어 RFTS가 결여된 DNMT1이 활성화되고 헤미메틸화된 기질 DNA를 메틸화할 수 있음을 확인했습니다. 형광 기반 분석에서, Gla I의 부재하에, DNMT1 또는 완충액의 첨가 단독은 배경 형광에 영향을 미치지 않았다. 이후 모든 분석에 Gla I을 첨가하면 DNMT1을 포함하는 분석에서만 형광이 생성되었습니다.
RFTS가 부족한 DNMT1과 Gla I을 3개의 분석에 동시에 첨가하여 강력한 형광을 생성했습니다. Gla I의 첨가 단독으로는 형광이 생성되지 않았습니다. 잠재적 억제제를 스크리닝하기 위해, RFTS-결핍 DNMT1의 DNA 메틸화 활성을 DMSO, 화합물 1, 화합물 2 또는 화합물 3의 존재 하에 20 및 50 마이크로몰 농도에서 조사하였다.
이 결합 분석에서 형광 생성을 감소시키는 화합물은 추가로 검증되어야 합니다. 화합물이 커플링 효소를 억제하지 않는지 확인하는 것은 중요한 다음 단계입니다.
