Этот протокол позволяет культивировать микроглию в условиях, близко имитирующих характеристики in vivo. Используя технологию сортировки магнитных клеток, наш протокол позволяет нам стимулировать микроглию только два дня in vitro, без использования какой-либо сыворотки в питательной среде. Для начала используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать кожу от шеи до носа, следуя за сагиттальным швом от 15 до 20 миллиметров.
Вставьте кончики с большим отверстием, параллельным черепу. Вырежьте с каждой стороны до глаз. Разрезайте между глазами маленькими ножницами, чтобы отделить череп и мозг от головы.
Двумя щипцами схватите череп близко к обонятельным луковицам и осторожно порвите череп. Лезвием бритвы удалите мозжечок и обонятельную луковицу и разрежьте мозг на две части. Поместите кусочки мозга в чашку Петри, содержащую 40 миллилитров HBSS без кальция и магния.
Приготовьте диссоциационную смесь согласно этой таблице. Переложите 12 кусочков мозга в трубку С общим весом 1,2 грамма на диссоциационную трубку. Затем поместите трубки С на диссоциатор с нагревом.
Запустите оптимизированную программу NTDK в диссоциаторе. Центрифуга на 20 секунд. Завершите механическую диссоциацию, трижды пипетировав.
Переложите ячейки на четыре 15-миллилитровые трубки с прикрепленными сетчатыми фильтрами. Смойте ситечки 10 миллилитрами HBSS кальцием и магнием. Центрифугируйте в течение 10 минут и удалите супернатант с помощью 10-миллилитровой пипетки.
Осторожно добавьте 10 миллилитров HBSS с кальцием и магнием и повторно суспендируйте гранулу. Опять же, центрифугируйте и удалите супернатант. Повторно суспендировать гранулу с шестью миллилитрами сортировочного буфера.
Повторите центрифугирование и выбросьте супернатант. Затем добавьте 200 микролитров раствора микрогранул CD11b и инкубируйте пробирки в течение 15-20 минут при четырех градусах Цельсия. После инкубации повторно суспендировать гранулу с шестью миллилитрами сортировочного буфера.
Повторите центрифугирование и повторно суспендируйте гранулу с восемью миллилитрами сортировочного буфера. Затем следуйте программе Possel на сепараторе, чтобы подготовить восемь колонок. Пропустите ячейки через столбец, добавляя по одному миллилитру клеточной суспензии за раз.
С помощью одного миллилитра сортировочного буфера элюируют CD11b-положительные клетки на стерильной пластине элюирования. Объедините ячейки в 50-миллилитровую трубку. Центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу с 10 миллилитрами холодной микроглиевой среды.
Подсчитайте CD11b-положительные клетки. Повторно суспендировать клетки в холодной среде микроглии, чтобы получить конечную концентрацию от 650 000 до 700 000 клеток на миллилитр. Дозировать суспензию в пластинах клеточной культуры.
Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислым газом. На следующий день замените среду предварительно нагретой средой микроглии и повторите ночную инкубацию. Стимулируйте клетки перед этим этапом и выполняйте фагоцитарный анализ в течение последних трех часов стимуляции.
Рассчитайте количество бусин согласно этой таблице в соотношении 50 бусин на ячейку. Приготовьте смесь бисера. Высиживать трубку в течение одного часа на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.
Вихрь каждые 10 минут. К каждой лунке добавить рассчитанный объем бисерного раствора и инкубировать в течение трех часов. Используя этот подход, фагоцитарную активность микроглии оценивали после стимуляции провоспалительными факторами, такими как интерлейкин-1 бета, плюс интерферон гамма или липополисахариды.
После стимуляции в течение шести-24 часов флуоресцентные шарики микроглии Cy3 анализировали с помощью конфокального микроскопа. Через шесть часов микроглия начинает фагоцитарными шариками Cy3 только при интерлейкине-1 бета плюс интерферон гамма-состоянии. Через 24 часа наблюдалось увеличение флуоресценции Cy3 для обоих видов стимуляции, что подчеркивало повышенную фагоцитарную активность.
Чистота культуры микроглии была повышена с помощью проточной цитометрии, которая показала увеличение жизнеспособности клеток после сортировки. С помощью проточной цитометрии и маркеров популяции клеток RT-qPCR были проанализированы до и после сортировки CD11b-положительных клеток из мозга мышей на восьмой послеродовой день. Эти анализы различали различные популяции клеток мозга, такие как CX3CR135 для микроглии, O4 или OLIG2 для олигодендроцитов, NeuN или синаптофизин для нейронов и ACSA-2 или GFAP для астроцитов.
После сортировки клеток с использованием антитела CD11b были получены только микроглии. Важно очень осторожно добавлять суспензию в колонну, чтобы предотвратить засорение и избежать механической гибели клеток. После этого метода можно выполнить транскриптомную протеомику, такую как западная кровь, или Luminex, и даже иммунохимию, чтобы увидеть эффект стимуляции микроглии.
