На сегодняшний день церебральные органоиды, дифференцированные от плюрипотентных стволовых клеток, представляет собой 3D-модель vitro, наиболее близкую к нативной ткани мозга человека. Дополнительно церебральные органоиды одинаково подходят для моделирования различных патологий центральной нервной системы, тестирования фармакологически активных веществ, а также для применения в регенеративной медицине. Между тем, эта технология все еще находится на начальной стадии развития.
Протокол можно разделить на две группы в зависимости от способа получения агрегатов и дальнейшего культивирования с дифференцировкой. Первый включает протокол и схемы дифференцировки, различные по времени культивирования и дифференцировке индуляторы с последующим созреванием органоида в шейкере в специальных устройствах с низкой адгезией, таких как рыночные трубки или пластины. Другая группа включает использование специальных биореакторов.
Анализ различных протоколов показал, что органоиды следует культивировать в условиях с циркулирующей питательной средой. Однако отсутствие простых и недорогих систем получения органоида со стандартными размерами и морфологией требует разработки таких устройств для масштабирования процесса. В данной работе мы описываем наш метод получения и тестирования простых и недорогих мини-биореакторов, которые позволяют получать большие количества высококачественных органоидов.
Нарежьте стерильные 15-миллилитров центрифужные трубки на кольца высотой 7 или 8 миллиметров. Автоклав колец. Разбейте низкоагрегации на обработанных или микробиологических чашках Петри на крошки.
Растворите около 1 грамма пластиковой крошки в 10 миллилитрах хлороформа на ночь, чтобы приготовить жидкий пластик. Сделайте пластиковую ручку в центре стерильной сверхнизкой адгезии 6 сантиметров чашки Петри. Есть два одинаково подходящих способа.
Первый, поместите автоклав в пластиковое кольцо по центру и нанесите полмиллилитров жидкого пластика на внутреннюю часть кольца. Второй, без каких-либо пластиковых колец, опускает полмиллилитров жидкого пластика на центр чашки Петри. Оставьте посуду открытой на 2 или 3 часа в ламинарной вытяжке до полного высыхания.
Культивируют индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в среде для плюрипотентных стволовых клеток, до 75 или 90% слияния в 35-миллиметровых чашках Петри, предварительно покрытых матрицей, растворенной в холодной среде Dulbecco Modified Eagle Medium и среде Fisher-12. Подготовьте среду А плюс замену сыворотки. Культивируют индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в течение 1 дня в среде с заменой сыворотки.
Замена среды для плюрипотентных стволовых клеток на среду замещения сыворотки в нулевой день дифференцировки. Приготовить среду А.Измените среду на среду А на 2 день дифференцировки. Культивируют клетки в среде А в течение 2 недель, освежая среду в чашках Петри каждые 2 дня.
На 14-й день начинают формирование сфероида с помощью специальной 24-скважинной культуральной пластины, которая содержит примерно 1 200 микроядер в каждой скважине. Подготовьте 24-скважинную культурную пластину с микроукладками. Добавьте к каждой лунке 1 миллилитр среды А, центрифугу ненадолго по 1, 300 г в течение 5 минут в ротор с качающимся ковшом, оснащенным держателем пластины.
Контролируйте под микроскопом, чтобы в микровеллах не было пузырьков. Приготовьте среду B.Выньте среду из чашки Петри. Для отслоения клеток обработают клетки 1,5 миллилитрами раствора ЭДТА, приготовленным на PBS.
Контролируйте отсоединение клеток под микроскопом. Соберите клетку в 15-миллилитровую трубку. Добавьте 5 миллилитров, смешанных дульбекко и среды Фишера в трубку по направлению к клеткам.
Центрифуга по 200г в течение 5 минут. Удаляют супернатант и повторно суспендированы клетки в 2 миллилитра среды В. Перенесите суспензию клеток, содержащую 1 миллиард клеток, в каждую лунку из 24-луночной пластины с микроэлементами. Осторожно пипетку клеток вверх и вниз несколько раз и центрифуг ненадолго 100 г в течение 1 минуты, чтобы захватить ячейку в микроэлементах.
Контролируйте под микроскопом, чтобы клетки равномерно распределялись в микроэлементах. Инкубировать пластину на ночь для агрегации клеток в сфероидах. На следующее утро, на 15-й день, проверьте под микроскопами качество сфероидов, которые прозрачны и гладки, если здоровы.
Осторожно соберите сфероиды из каждой лунки в 15-миллилитровую трубку, оставьте сфероиды выпадать в осадок под действием силы тяжести в течение 2 и 3 минут, а затем удалите супернатант. Добавьте к сфероидам 2 миллилитра матрицы, размороженных и временных на льду. Аккуратно перемешайте путем пипетки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
Для промывания излишков матрицы добавляют в трубку 8 миллилитров среды B.Pipette аккуратно, затем центрифугируют трубку в течение 1 минуты по 100г. Удалите супернатант. Добавьте в трубку 20 миллилитров среды В, аккуратно пипетку, затем разделите сфероидную суспензию между мини-биореакторами.
Затем поместите мини-биореакторы в 15-сантиметровую чашку Петри, которая предотвращает испарение воды и загрязнение. Поместите чашку Петри с мини-биореакторами на орбитальный шейкер. Культивируют органоиды со скоростью вращения 70, 75 об/мин.
На 16 день готовят среду С. Перенесите органоид в 50-миллилитровый тюбик. В течение 5 минут дайте им упасть на дно. Аспирировать супернатант и добавить 5 миллилитров среды C.Воссоединить органоиды в мини-биореакторах.
Культивируют сфероиды в среде С в течение 2 недель, освежая среду каждые 2 дня. В течение этих 2 недель выберите около 100 сфероидов на мини-биореактор для последующего культивирования. На 30 день готовят среду D.Измените культивационную среду на среднюю D, которая является средой созревания.
Обновляйте культивную среду каждые 2 или 3 дня в течение 3 недель. Затем используйте среду D, растворенный в F и GDNF. После 1 месяца последовательного культивирования в среде А и В получают органоиды, стандартизированные по размеру и морфологии.
По мере роста им нужно чаще менять среду, до 4 раз в неделю также увеличивается. После 2 месяцев выращивания они достигают 4 и 5 миллиметров в диаметре. А еще через месяц, 5 и 6 миллиметров и рост прекращается.
На рисунке показано появление органоидного фермента, четкие срезы, окрашенные гематоксилином и эозином. Иммуногистохимический анализ за 1 месяц показывает наличие у SOX2 положительных кластеров клеток-прародителя, в том числе внутри центральной части. В периферических органоидах глиальный фибриллярный кислый белок, микротрубоче-ассоциированный белок 2 и тиазингидролаза положительные.
Клетки концентрированные, что соответствует зрелой форме нейронов. В некоторых случаях в центральной части образуются скопления белых на некротической области. Это указывает на ограничение данного протокола для получения более крупных органоидов.
Скорее всего, ограничивающим фактором роста является скорость диффузии питательных веществ и кислорода. Различные среды и клеточные типы сфероидов и тестирование нашей системы на некоторые виды органоидов. Много мозга и сетчатки, комбинированные органоиды из клеток карциномы печени и мезенхимальных стволовых клеток, комбинированные органоиды из капитальных бластных мезенхимальных стволовых вызовов и дифференцировка гемопоэтических стволовых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и органоидов кишечника.
Был ли он переменным в первоначальном составе клеток? Факторы дифференциации, культуры и среды, внеклеточного матрикса, а возможно также состав газовой смеси, скорость вращения платформы и другие параметры. Можно будет получить органоид с одинаковой формой, размером или морфологической моделью в различных органах и тканях.
Использование мини-биореакторов предложено в этой работе.
