Мы представляем протокол создания органоида мозга человека, содержащего резидентную микроглию и нейроны, путем включения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из гемопоэтических прогенных клеток, в процесс индукции и развития нейрональных органоидов. Этот метод обеспечивает модель для изучения взаимодействия между микроглией и нейронами во время развития мозга человека. 3D-органоиды мозга — это мини-мозги, созданные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или ИПСК.
В качестве альтернативы животным и людям, они широко используются для имитации человеческого мозга в исследованиях развития мозга и неврологических расстройств. Они являются отличными инструментами для продвижения исследований в области здоровья человека. Традиционные протоколы для 3D-органоидов человеческого мозга редко генерируют микроглию, резидентную иммунную клетку человеческого мозга, поскольку эти клетки возникают из другой эмбриональной линии, чем нейроны.
В то время как микроглия может быть добавлена к органоидам мозга на более поздней стадии дифференцировки, необходим метод, позволяющий лучше имитировать развитие мозга человека. Большинство других протоколов добавляют HPC или микроглию в конце генерации органоидов головного мозга. Мы создаем эмбриоидные тельца из смешанных ИПСК и ГПК до нейронной индукции.
Это может лучше имитировать развитие человеческого мозга, поскольку предшественники микроглии мигрируют в мозг на очень ранних стадиях развития. Кроме того, использование высокопроизводительных вычислений экономит общее время дифференцировки, поскольку протоколы дифференцировки микроглии часто занимают более 30 дней. Таким образом, наш протокол позволяет сэкономить время и затраты на реагенты.
Для начала культивируют диссоциированные индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки или ИПСК в 12-луночном планшете, содержащем один миллилитр среды E8 Flex, инкубируют клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. На следующий день проверьте колонии под микроскопом и подсчитайте количество колоний, просканировав все поля в лунке. Замените среду одним миллилитром Медиума А из кроветворного набора.
Поместите тарелку обратно в инкубатор на 48 часов. На третий день замените 500 микролитров отработанной среды на 500 микролитров свежей среды А и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день наблюдайте за ростом и дифференцировкой клеток из колоний iPSC.
Замените среду одним миллилитром среды B. Отслеживайте дифференцировку клеток под микроскопом и выполняйте половинную замену среды на 500 микролитров среды B каждый день в течение шести-семи дней. На 10-й день наблюдайте наличие ярких одиночных круглых клеток с морфологией нормальных гемопоэтических клеток-предшественников, или ГПК, плавающих или слабо прикрепленных к клетке плоского слоя с помощью некоторых рыхлых агрегатов. Затем соберите все дифференцированные высокопроизводительные вычисления, трижды пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника для пипетки объемом в один миллилитр.
Переложите клетки в 15-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300G в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды В. Добавьте 20 микролитров клеточной суспензии в камеру для подсчета клеток и подсчитайте клетки с помощью клеточного измерителя. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 миллиона клеток на миллилитр с использованием среды В. Метод серийного разведения культуры позволил получить соответствующее количество и размеры колоний ИПСК с колониями, демонстрирующими значительные морфологические изменения к концу культивирования в среде А. После трех дней в среде В наблюдалась дифференцировка ГПК с появлением однородных круглых клеток.
На 10-й день HPC преимущественно образовывали колониевидные кластеры без значительного мусора. После сбора данных HPC, дифференцированных от человеческих iPSC, убедитесь, что культура iPSC достигла 80% конфлюенции. Добавьте 500 микролитров раствора для промывки, препятствующей прилипанию, в одну лунку микролуночного планшета, сводя к минимуму образование пузырьков.
Вращайте пластину при перегрузке 2 000 G в течение пяти минут в качающемся роторе ковша, оснащенном держателями пластин. Полностью удалите промывочный раствор и дважды промойте лунки одним миллилитром DPBS, а затем одним миллилитром DMEM/F-12 без образования пузырьков. Обработайте ИПСК одним миллилитром раствора АККУТАЗЫ, чтобы инициировать диссоциацию клеток.
Наблюдайте за клетками под микроскопом, отмечая признаки разделения клеток, пока клетки остаются прикрепленными ко дну. Замените раствор АККУТАЗЫ одним миллилитром среды DMEM/F-12, затем перемешайте вверх и вниз, чтобы разделить клетки на отдельные клетки. Перенесите диссоциированные клетки в 15-миллилитровую пробирку и добавьте среду DMEM/F-12, чтобы достичь конечного объема в пять миллилитров.
Центрифугируйте ячейки при 300G в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды E8 Flex. Подсчитайте ячейки, чтобы отрегулировать концентрацию клеток до 1 миллиона клеток на миллилитр в среде E8 Flex. Затем смешайте иПСК с высокопроизводительными вычислениями в соотношении два к одному в лунку микролуночного планшета.
Добавьте один микролитр стокового раствора ROCK Inhibitor Y-27632 на один миллилитр среды в надосадочную жидкость и встряхивайте пластину из стороны в сторону. Вращайте планшет при температуре 300G в течение пяти минут и наблюдайте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки осели в микролунках. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.
Через 48 часов наблюдайте за клетками под микроскопом на предмет образования эмбриоидных телец, или БЭ. Затем обработайте 24-луночный планшет для клеточных культур 500 микролитрами буфера для промывки, препятствующей адгезии, в течение 15 минут, чтобы создать пластину с низким уровнем прикрепления. Дважды промойте лунки одним миллилитром DPBS и добавьте в каждую лунку по одному миллилитру среды E8 Flex.
С помощью наконечника для пипетки шириной в один миллилитр суспендируйте БЭ в планшете для микролунок. Затем для каждой лунки 24-луночного планшета с низким уровнем прикрепления добавьте 100 микролитров среды, содержащей БЭ. Инкубируйте планшет в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом в течение 48 часов.
Для начала разморозьте аликвоты матрицы базальной мембраны на льду в течение 30 минут. На второй день после образования БЭ с помощью предварительно охлажденного наконечника для пипетки объемом 20 микролитров добавьте 15 микролитров ледяной матрицы базальной мембраны небольшими каплями поверх среды, чтобы покрыть БЭ. Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом на 48 часов.
На четвертый день после образования БЭ осторожно удалите 500 микролитров среды, не нарушая БЭ, и повторите нанесение покрытия матрицы базальной мембраны, как было показано ранее. Затем добавьте 500 микролитров плюрипотентной среды для индукции нервов поверх клеток. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.
На шестой и восьмой день выполните полусреднее изменение, осторожно заменив 500 микролитров среды на 500 микролитров свежей среды для нервной индукции. После инкубации на 10, 12 и 14 день проведите полусреднее изменение с помощью среды нейральных стволовых клеток. На 15-й день переложите хорошо содержащие сферы вместе со средой в новую 12-луночную пластину, обработанную раствором для промывки, препятствующей адгезии.
Добавьте 500 микролитров среды для созревания нейронов поверх культуры. На стадии созревания следите за средой на предмет признаков истощения питательных веществ, таких как изменение цвета. Если наблюдается истощение питательных веществ, переложите органоид в шестилуночную пластину.
На 17-й день дополните среду созревания цитокинами в течение шести дней, чтобы облегчить созревание микроглии. Наконец, на 23-й день соберите полученные нервные органоиды для характеризации. Высококачественные смеси HPC и iPSC образовывали EB в течение 24 часов, демонстрируя непрерывный рост и минимальное количество мусора.
После переноса на новую пластину EBS продолжала расти до достижения плато в среде созревания.
