Митохондрии обеспечивают клеточную энергию путем окислительного фосфорилирования, способствуя почти всем процессам в клетке. Следовательно, митохондриальные дисфункции связаны с широким спектром заболеваний. Основным преимуществом данного метода является измерение в реальном времени митохондриальной биоэнергетики по потреблению кислорода, и, таким образом, точная оценка общего клеточного энергетического метаболизма.
Респирометрия с высоким разрешением позволяет напрямую оценить, что в системе окислительного фосфорилирования терпит неудачу, потенциально предоставляя диагностические подсказки при первичных митохондриальных заболеваниях и вторичных митохондриальных дисфункциях, связанных со многими расстройствами. Демонстрировать процедуру будет Райан Авадхперсад, аспирант в моей лаборатории. Для начала выполните калибровку кислорода, запустив респирометры в 2,1 миллилитрах митохондриальной среды дыхания при 37 градусах Цельсия в течение более 45 минут и продолжайте, если исходное изменение находится в пределах четырех пикомол в секунду.
Культивирование клеток HEK293 в высокоглюковом DMEM, дополненное 10% термоактивированным FBS, GlutaMAX, заменимыми аминокислотами, пируватом натрия и уридином в инкубаторе при 37 градусах Цельсия при 5% углекислого газа. В день эксперимента соберите и подсчитайте клетки и повторно суспендируйте 2,5 миллиона клеток в 2,5 миллилитра дыхательной среде. Чтобы оценить рутинное дыхание, добавьте в камеру 2,3 миллилитра суспензии теплых среднеклеточных дыхательных клеток.
Работайте в камерах при температуре 37 градусов Цельсия и скорости перемешивания 700 об/мин. Подождите не менее трех минут, чтобы дать среде дегазироваться, затем закройте камеры, покрутив пробку во вращающемся движении. Затем аспирируйте лишнюю жидкость поверх пробки.
Через 10 минут получите стабильный сигнал потока кислорода для записи рутинного или состояния I дыхания. Для выполнения анализа OXPHOS в интактных клетках добавляют два микролитра 0,01-миллимолярного олигомицина для конечной концентрации 10-наномолярного. Титруйте FCCP из двухмиллимолярного запаса, добавляя 0,6 микролитра на шагах 0,2 микролитра до тех пор, пока не будет наблюдаться увеличение дыхания и дыхание не будет максимально отсоединено.
Далее добавляют один микролитр одномиллимолярного ротенона для конечной концентрации 0,5-микромолярного. Затем добавьте два микролитра по одному миллиграмму на миллилитр антимицина для окончательной концентрации одного микрограмма на миллилитр. Повторное насыщение камеры до того же уровня кислорода, примерно 150-микромолярного, путем подъема плунжера.
После этого добавьте пять микролитров 0,8-молярного аскорбата для конечной концентрации двухмиллимолярного. Затем сразу добавляют пять микролитров 0,2-молярного TMPD для конечной концентрации 0,5-миллимоляра и оценивают комплексную активность IV. Когда пиковый поток кислорода достигается с TMPD, добавьте пять микролитров или четырехмолярный азид для конечной концентрации 10-миллимоляров.
Затем продолжайте работу в течение не менее пяти минут, чтобы проанализировать автоокисление TMPD для сложного расчета базового уровня IV. После пробега собирают по одному миллилитру суспензии образца из каждой камеры и центрифуги при 1000 г для пермеабилизированных клеток или в 20 000 г для тканевого лизата. Затем выбросьте супернатант и заморозьте гранулу при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
Во-первых, засейте клетки в соответствии со скоростью роста отдельных клеточных линий. Разбавляют олигомицин, FCCP, ротенон и антимицин в трех микролитрах исследуемой среды до конечной концентрации 1,5-микромолярного, 1,125-микромолярного и одномикромолярного соответственно. Впоследствии заполните их в отдельные порты.
Соблюдайте порты впрыска, чтобы обеспечить равномерную загрузку образцов. Включите систему на основе микропластин и компьютер и уравновесьте их при 37 градусах Цельсия в течение не менее трех часов. В день анализа на основе микропластины проверьте слияние пластины клеточной культуры, морфологию клеток и убедитесь, что фоновые колодцы пусты.
Затем удалите из каждой лунки все, кроме 20 микролитров питательной среды. Затем промыть каждую лунку 90 микролитрами пробирной среды и добавить 100 микролитров пробирной среды, чтобы получить конечный объем до 120 микролитров. Далее высиживают пластину при 37 градусах Цельсия в инкубаторе без углекислого газа в течение 60 минут.
После извлечения пластины из инкубатора снимите крышку и поместите микропластинку в прорезь. Нажмите кнопку Продолжить, чтобы начать запуск. После того, как прогон закончится, выньте пластину и удалите оставшиеся пробирные среды, не нарушая клетки.
Затем заморозьте всю пластину при минус 80 градусах Цельсия. После проведения экспериментов по пермеабилизации и дыханию дигитонина были зарегистрированы следы потребления сырого кислорода клетками HEK293 дикого типа и клетками HEK293 с нокаутом гена, опосредованным CRISPR, что привело к множественным дефицитам OXPHOS. Получены наложенные клеткой входные-нормированные следы потребления кислорода.
Нокаут CRISPR 1 показывает нарушение дыхания, а нокаут CRISPR 2 не показывает дыхания по сравнению с диким типом при нормализации до числа клеток. Количество белка было количественно определено, а значения дыхания нормализованы до количества белка, чтобы определить абсолютные значения дыхательных состояний и соответствующие коэффициенты контроля потока. Было обнаружено, что скорость внеклеточного подкисления увеличивается для дефицита OXPHOS в нокауте CRISPR 2, что предполагает компенсацию дефицита митохондриального окислительного фосфорилирования в клетках HEK293 за счет увеличения гликолиза.
Кроме того, значения дыхания определяли в присутствии олигомицина, FCCP и ротенона, а полученные значения нормализовали до количества белка. Были изучены нормализованные белком следы потребления кислорода клетками HEK293 дикого типа и клетками HEK293 с CRISPR-опосредованным дефицитом митохондриальной трансляции, вызывающим множественный дефицит OXPHOS. Получена нормализованная влажная масса тканей при нормированном потреблении кислорода следами мозжечка мыши и камбаловидной мышцы мыши.
Камбаловидные мышцы показывают в три раза более высокий ОКСФОС и дыхательную способность, чем мозжечок. При камерной респирометрии важно работать быстро, так как митохондриальная функция будет снижаться в тот момент, когда вы собираете образцы, а при пластинчатой респирометрии крайне важно приобрести оптимальную плотность посева, чтобы свести к минимуму изменчивость. Для дальнейшего анализа возможна количественная оценка белка или иммуноблоттинг.
Это может определить, было ли изменение в дыхательной функции митохондрий связано с обилием комплексов OXPHOS или митохондриальным количеством. Уже столетие назад было обнаружено, что раковые клетки выполняют анаэробный гликолиз в дополнение к митохондриальному ОКСФОСУ. Это подчеркивает необходимость анализа митохондриальной биоэнергетики.
Здесь мы продемонстрировали два респирометра, считающихся сегодняшним золотым стандартом.
