Этот протокол имеет большое значение, поскольку он позволяет целенаправленно манипулировать плацентами мыши с помощью CRISPR. Это позволит исследователям выяснить конкретные функции генов во время средней и поздней беременности. Генетические манипуляции, вызывающие чрезмерную экспрессию в плаценте мыши, встречаются очень редко.
Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить ряд изменений экспрессии генов в плаценте. Не расстраивайтесь, если предварительные сроки у этой методики окажутся неудачными. Поскольку эта техника сложна, для ее освоения требуется довольно много времени.
Для начала поместите обезболиваемую матери на спину с носовым конусом для поддержания анестезии в области препарирования. Тщательно побрейте брюшко плотины. Чтобы предотвратить высыхание роговицы, нанесите искусственный слезный гель на оба глаза плотины.
Затем используйте стерильные аппликаторы с ватными наконечниками для дезинфекции места операции не менее чем тремя чередующимися раундами раствора повидон-йода, а затем 70% этанола с последним слоем раствора повидон-йода. После подготовки переместите плотину с носовым конусом анестезии в назначенную операционную зону. Для лапаротомии матки поместите лежа на спине на операционном столе и закрепите конус носа на месте с помощью ленты.
Поместите грелку под впитывающую прокладку, установленную на 45 градусов по Цельсию. После подтверждения глубины анестезии по отсутствию рефлюкса при защемлении пальцев ног используйте щипцы и ножницы, чтобы сделать примерно двухсантиметровый разрез по средней линии через закрытую кожу. Затем делают вертикальный разрез через брюшину с помощью стерильных щипцов, аккуратно отщипывающих от рогов матки.
Массируйте оба рога матки, надавливая пальцами на обе стороны живота, чтобы направлять их. Поместите открытую матку поверх стерильных хирургических простыней, размещенных над нижней частью живота, и держите ее влажной с каплями теплого стерильного физиологического раствора по мере необходимости. После того, как матка обнажена, выберите три пары плацент для манипуляции.
Зафиксируйте место проведения плацентарных манипуляций и организацию эмбрионов в пределах рогов матки. Для плацентарной инъекции контрольной плазмиды загрузите достаточное количество соответствующей контрольной плазмиды для трех инъекций с помощью калиброванной микропипетки. Выполняйте все инъекции между децидуа и соединительной зоной на глубине примерно 0,5 миллиметра латерально в плаценту.
После инъекции, но непосредственно перед электропорацией, покройте места контакта стерильным физиологическим раствором, нанося физиологический раствор точно на три участка на стенке матки и лопатки с помощью капельницы или шприца. В течение двух минут после инъекции выполните электропорацию с помощью пары трехмиллиметровых лопастей, прикрепленных к электропорационной машине. Чтобы обеспечить эффективность включения CRISPR и жизнеспособность эмбрионов, отрегулируйте настройки на 30 вольт, 30-миллисекундный импульс, два импульса, 970-миллисекундный импульс выключен и униполярный.
Аккуратно надавите электропорационными лопатками на стенки матки с боковых сторон плаценты. Поместите лопасть анода над местом впрыска и катодом прямо напротив. Нажмите на импульс на электропорационной машине и дождитесь завершения двух импульсов, прежде чем снимать электропорационные лепестки.
Затем приступают к плацентарной инъекции экспериментальной плазмиды, как показано ранее. Проведите электропорацию всех трех экспериментальных инъецированных плацент в течение двух минут после инъекции, как это было сделано в контрольной группе. После завершения манипуляций с плацентой аккуратно помассируйте рога матки обратно в брюшную полость, используя только пальцы, чтобы непосредственно манипулировать рогами матки.
Выполните прерывистые швы на брюшинном слое, используя 45-сантиметровые и плетеные рассасывающиеся швы из 13-миллиметрового круга из игольчатого сплава длиной три восьмых. После наложения швов на слой брюшины наложите на кожу рассасывающиеся швы, используя тот же тип рассасывающихся швов, что и брюшину. После завершения наложения швов нанесите тканевый клей на швы на коже.
Когда тканевый клей высохнет, выключите испаритель и перенесите плотину из области операции в поддерживающую клетку на спине. Плацентам вводили общую контрольную плазмиду CRISPR Cas9 и контрольную плазмиду активации CRISPR или плазмиду активации IGF-1 SAM. Репрезентативные изображения после вскрытия не показали заметных повреждений или изменений в фенотипическом виде ни в одной из групп лечения.
Выживаемость необработанных эмбрионов в модифицированных пометах снизилась в среднем до 79,05%, в то время как выживаемость обработанных эмбрионов значительно снизилась в среднем до 55,56%Существенной разницы в весе плаценты ни в одной группе не было. Не было существенной разницы в увеличении веса матери сразу после операции по сравнению с фиктивными операциями. У многих беременных женщин наблюдалось небольшое снижение или отсутствие изменений в весе на следующий день после процедуры, вероятно, из-за нарушения приема пищи во время и вскоре после операции.
Большинство плотин показали увеличение веса на E14.5, но иногда снижение веса все же наблюдалось. КПЦР показала значительное увеличение экспрессии IGF-1 в плацентах с избыточной экспрессией IGF-1 по сравнению с контрольными плацентами. Оценка ELIZA плаценты E14.5 показала значительное повышение уровня белка IGF-1 в плацентах с избыточной экспрессией IGF-1 по сравнению с контрольными плацентами.
Зеленая аутофлуоресценция продемонстрировала субобласти интерфейса плацентарного материнского плода с красной маркировкой Cas9 только в плаценте гиперэкспрессии IGF-1, что указывает на успешное включение CRISPR во все три субобласти плаценты. Флуоресцентная маркировка при С2-гибридизации подтвердила включение активационной плазмиды IGF-1 без миграции в необработанные плаценты. Децидуальная и лабиринтная зона могут быть идентифицированы вокруг красной зоны соединения, отмеченной окрашиванием Prl8a8.
Не забудьте записать тип манипуляции и расположение плаценты и соответствующих эмбрионов. Настоятельно рекомендуется регистрировать расположение шейки матки и эмбрионов в рогах матки. После этой процедуры может быть выполнен анализ плаценты, эмбриона и матери.
Это позволит лучше понять специфические роли генов плаценты в беременности, плацентарной функции и эмбриональном развитии.
