Этот протокол позволяет количественно оценить уровни и динамику метилирования аргинина. Эта модификация играет важную регулирующую роль и может служить биомаркером заболевания. Преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает простой рабочий процесс для практически неограниченного числа матриц, начиная от клеток, сред и заканчивая тканями и биожидкостями.
Метилирование аргинина повышено при многих видах рака человека, и первые ингибиторы трансфераз аргининового метода тестируются в клинических испытаниях. Этот метод может помочь со стратификацией пациентов и оценкой риска. Продемонстрировать процедуру будет Хансйорг Хабиш, техник-исследователь из моей лаборатории.
Для жидких образцов добавьте 400 микролитров ледяного метанола к 200 микролитрам образца с последующей инкубацией в течение 30 минут при минус 20 градусах Цельсия. Центрифугируйте этот образец при 10 000 Г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Переместите супернатант и соберите гранулу в 1,5 миллилитровые трубки.
Для твердых материалов добавьте 600 микролитров 66% метаноловой воды в пульпочные трубки, содержащие от 30 до 60 миллиграммов ткани или клеточных гранул. Гомогенизируйте мягкие ткани один раз в течение 20 секунд и жесткую ткань два раза в течение 20 секунд с пятиминутным интервалом между ними. Немедленно поместите образец на лед и перенесите весь лизат в новую 1,5-миллилитровую трубку с последующей инкубацией.
Затем центрифугируйте образец при 10 000 Г в течение 30 минут. При четырех градусах Цельсия выберите супернатант в 1,5-миллилитровых трубках и приступайте к гидролизу белка с использованием этого супернатанта. Усекайте колпачки каждой трубки.
Затем добавьте 500 микролитров девяти молярной соляной кислоты к каждому образцу. Наконец, поместите трубки в стеклянные трубки. Плотно закройте их колпачками, обеспечив надлежащую герметизацию, и поместите эти трубки в стеклянный стакан, частично заполненный песком.
Гидролизуйте образцы в течение 16 часов при температуре 110 градусов Цельсия в сушильной камере. Охладите образцы и лиофилизируйте их на ночь с помощью высоковакуумной центрифуги. На следующий день растворите полностью высушенные гранулы в одном миллилитре 0,1 молярной соляной кислоты.
Добавьте 50 микролитров хлороформа в каждую пробирку и тщательно растворите гранулу с помощью пипетки объемом 1000 микролитров. Перенесите весь объем в новую трубку и центрифугируйте образцы в течение 10 минут. Тщательно соберите верхнюю фазу двухфазной жидкости в новую трубку.
Используйте пластиковые трубки для ручной или стеклянные трубки для роботизированной твердофазной экстракции. Для ручной твердофазной экстракции предварительно кондиционируйте картриджи в каждом прогоне с последующим центрифугированием в течение одной минуты. После этого загрузите образец на картриджи SPE и центрифугируйте их при 600 Г в течение двух минут при комнатной температуре.
Промыть картриджи одним миллилитром воды три раза, каждую промывку с последующей центрифугированием в течение одной минуты. Затем промыть пять раз одним миллилитром 0,1 молярной соляной кислоты с последующим центрифугированием в течение одной минуты при 800 г при комнатной температуре. Дважды промыть картриджи одним миллилитром метанола с последующим центрифугированием в течение одной минуты.
Элют аргинин и его производные в одну 15-миллилитровую трубку путем добавления одного миллилитра из трех заменяющих растворов X и центрифуги дважды в течение одной минуты. Для роботизированной твердофазной экстракции поместите трубки для сбора элюатов и стеклянные трубки, содержащие верхнюю фазу двухфазной жидкости, в соответствующее положение робота. Используйте приложение или метод в программном обеспечении на основе шагов, описанных для ручного SPE.
Лиофилизируйте образцы на ночь, чтобы полностью высохнуть, чтобы избавиться от аммиака и воды. Растворите каждый образец в 500 микролитрах ЯМР-буфера до тех пор, пока он не станет однородным. Затем перенесите равное количество однородного образца в каждую ЯМР-трубку.
Здесь показаны спектры J-RES гидролизатов дрожжевого белка, очищенных с использованием протокола SPE. Различные характерные химические сдвиги могут различать L-аргинин и ADMA на уровне 3,25 и 3,02 частей на миллион. Оба вещества могут быть разделены и количественно определены в клеточном матриксе.
Основываясь на количестве протонов конкретной метильной или метиленовой группы при соответствующем химическом сдвиге, одна спектроскопия ядерного магнитного резонанса H позволяет точно определить. Используя этот подход, химические сдвиги ядерного магнитного резонанса SDMA и MMA могут быть разделены и количественно определены характерными химическими сдвигами на уровне 2,76 частей на миллион SDMA и 2,74 частей на миллион MMA. При выполнении этого протокола тщательно соберите верхнюю фазу двухфазной жидкости, содержащей водорастворимую фракцию, пипеткой и переложите ее в новые трубки.
Используйте 1,5-миллилитровые трубки для ручного SPE или классное стекло для роботизированного SPE. Избегайте разлива хлороформа и его содержимого. Элюаты, содержащие аргинин и метилированные виды аргинина, анализируют с помощью ЯМР-спектроскопии.
Это дает абсолютное количество этих видов. Наша технология в настоящее время используется во множестве фундаментальных исследовательских проектов, направленных на анализ патофизиологической роли метилирования аргинина. Кроме того, мы оцениваем метилирование белка аргинина в качестве кандидата на биомаркеры при нескольких заболеваниях человека.
