Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммуносупрессивного терапевтического вмешательства для изучения неблагоприятного воздействия препаратов на регенерацию тканей, в частности, в костях. Основным преимуществом этой техники является то, что она сочетает в себе прошлые модели регенерации костей зебры с системным воздействием наркотиков путем погружения раненых зебрафиш в лекарственно-дополненной рыбной воде. Перед началом процедуры автоклав одной алюминиевой фольги покрыл 600 миллилитров стакана на зебрафиш и соответствующее количество стеклянных бутылок рыбной воды для эксперимента и подготовить иммуносупрессивный препарат в экспериментальных контрольных решениях, представляющих интерес.
Для ампутации травмы, используйте тупые типсы, чтобы тщательно поместить обезболивающее Зебрафиш на боковую сторону на обратной крышке 100-миллиметровой чашки Петри и использовать скальпель, чтобы повторно 50% плавника. Затем поместите рыбу в автоклавный стакан, содержащий 300 миллилитров рыбной воды, дополненной соответствующим экспериментальным агентом, и накройте стакан фольгой, чтобы предотвратить побег зебры. Чтобы вызвать травму перелома плавника, поместите обезболивающее Зебрафиш на боковую сторону в 100-миллиметровую агарозу с покрытием чашки Петри под рассеченным микроскопом и слегка нажмите инъекционной иглой в сегмент костного плавника, пока трещина не появится.
Важно ввести не слишком много переломов в плавник, потому что это может значительно ухудшить стабильность. Затем перенесите рыбу в автоклавный стакан, содержащий 300 миллилитров рыбной воды, дополненный соответствующим экспериментальным агентом. Для получения травмы голгофального черепа держите обезболивающее Зебрафиш в вертикальном положении, чтобы голгофальные кости легко визуализировались под микроскопом вскрытия.
Поместите вращающееся микросверло, оснащенное 500-метровым дрелью, немного по центру лобной кости и аккуратно коснитесь кости, чтобы произвести отверстие размером с микробуровую заусенца. Очень важно, чтобы не перемещать сверло боковой при производстве травмы и немедленно остановить, как только сопротивление ткани падает. В противном случае, мозг будет поврежден.
Затем поместите рыбу в автоклавный стакан, содержащий 300 миллилитров рыбной воды, дополненный соответствующим экспериментальным агентом. Изменение воды в стаканах ежедневно путем передачи Зебрафиш и рыбной воды в соответствующий временный контейнер и заправки стакан со свежим препаратом дополненной рыбной водой. Затем используйте рыбную сетку, чтобы вернуть зебру рыбу в стакан.
Для лечения продолжительностью до двух дней в общей сложности, не кормить зебрафиш. Во время более длительных экспериментов, кормить зебрафиш с 0,5 до одного миллилитра вылупившихся Артемия SSP каждый второй день. Для анализа травмы плавника, урожай штрафа и использовать штраф типсов, чтобы схватить плавник на одном краю пень.
Используйте вторую пару типсов, чтобы захватить противоположный край пень и слегка нажмите ткани на дно блюда, которое содержит холодные 4%PFA в течение 10 до 20 секунд. Повторите уплощение плавника по мере необходимости. Теперь плавник должен лежать ровно без завивки.
Для длительного хранения образца после фиксации, мыть ткани с тремя 20 минут PBS моет и восходящей серии метанола. Образцы могут храниться в 100% метанол при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для Ализарин Красное окрашивание, регидратировать метанол хранится образцов в нисходящей серии метанола следуют две 20 минут моет в PBS и одна пятиминутная стирка в деионизированной воде.
После последней стирки добавьте в образец ткани Алисарин Красный раствор и инкубировать образец при комнатной температуре с качания для соответствующего периода окрашивания. Чтобы очистить образцы, лечить ткани с уменьшением 1%калия гидроксида глицерол серии. Затем храните образцы в один к одному 0,1%калия гидроксида до 80%глицерола раствора и смонтировать ткани с 80%глицерол для воображая.
Для окрашивания кальцеина инкубировать до трех зебрафиш одновременно в 100 миллиметрах раствора calcein в течение 20 минут в стеклянном стакане, покрытом алюминиевой фольгой. В конце инкубации перенесите зебрафиш в контейнер с рыбной водой и дайте рыбе ненадолго поплавать, прежде чем перевести их в новый контейнер с рыбной водой. Через 20 минут во втором стакане, чтобы приобрести живые изображения плавника регенерирует, место анестезировал Зебрафиш на агарозы покрытием Петри блюдо и изображение плавника стерео микроскопии.
Чтобы получить изображения регенерирующих костей черепа, поместите зебрафиш в вертикальном положении в губку и изображение черепа с помощью микроскопии флуоресценции. Лечение преднизолоном, как и другие глюкокортикоиды, приводит к общему ингибированию регенерации плавников, включая формирование костей, как обнаружено Alizarin Red окрашивание фиксированной ткани хвостового плавника. Аналогичным образом, препарат имеет задержку влияние на калгофа травмы черепа закрытия.
Из-за иммуносупрессии, снижение макрофага номера также могут быть обнаружены иммуногистохимии на замороженных участках тканей, о чем свидетельствует с помощью анти-mCherry и анти-GFP антитела окрашивания и трансгенных MPEG-1 mCherry скрещены с Osterix NGFP Зебрафиш на зебрафиш черепа ткани образцов из Prednisolone обработанных животных. При попытке этих процедур важно свести к минимуму изменчивость скорости регенерации костей путем проведения травмы эссе в весьма воспроизводимым образом. Кроме того, имеет решающее значение для одного дома Зебрафиш в автоклавных стаканов, содержащих автоклавной рыбной воды, чтобы избежать микробной инфекции.
Этот протокол поможет в дальнейшем рассмотреть основные механизмы глюкокортикоида действий. Например, в контексте глюкокортикоида индуцированный остеопороз, а также может быть адаптирован для использования других препаратов и других костей зебры.
