Воспалительное заболевание кишечника, или ВЗК, налагает значительное бремя на здоровье и финансовое бремя на отдельных лиц и общество. Эта модель колита полезна для изучения механизмов ВЗК и оценки методов лечения ВЗК. Эта иммунодоминантная модель флагеллина Cbir, специфичная для Т-клеток, дает представление о том, как антиген кишечных бактерий индуцирует ответы Т-клеток, чтобы вызвать колит.
После усыпления мыши сделайте примерно сантиметровый левый разрез живота и оттяните кожу от брюшной мышечной ткани. Затем делают примерно трехсантиметровый разрез в брюшной мышечной ткани. Далее удаляют селезенку стерильными ножницами и щипцами.
Поместите селезенку в культурную посуду, содержащую пять миллилитров предварительно охлажденного промывочного буфера. Измельчите селезенку шероховатой поверхностью двух стерильных стеклянных слайдов. Перенесите клеточную суспензию в 50-миллилитровую центрифужную трубку, проведя ее через 100-микрометровый клеточный сетчатый фильтр.
Промойте стеклянные горки и посуду для культивирования пятью миллилитрами предварительно охлажденного буфера для стирки и переложите буфер стирки в трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки пятью миллилитрами предварительного буфера лизиса хлорида аммония Tris на селезенку. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
Добавьте в трубку 10 миллилитров предварительно охлажденного промывочного буфера. Затем центрифугируют клеточную суспензию, отбрасывают супернатант и повторно суспендируют клетки 10 миллилитрами предварительно охлажденного изоляционного буфера. Чтобы подсчитать ячейки, тщательно смешайте по 10 микролитров клеточной суспензии и трипанов синего цвета и загрузите 10 микролитров на слайд.
Затем вставьте слайд в автоматический счетчик ячеек, чтобы получить жизнеспособный номер ячейки. Центрифугируйте оставшуюся клеточную суспензию и выбросьте весь супернатант. Вихрь магнитных частиц CD4 против мыши, непосредственно добавьте 50 микролитров частиц на 10 миллионов клеток и тщательно перемешайте с гранулами клеток.
Инкубировать смесь в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите суспензию частиц клетки в стерильную сборную трубку. Добавьте в трубку 3,5 миллилитра предварительно охлажденного изоляционного буфера.
Поместите трубку на магнит разделения ячеек на восемь минут при комнатной температуре. Затем осторожно аспирируйте супернатант трехмиллилитровой переносной пипеткой. Извлеките трубку из магнита разделения ячеек.
Затем повторно суспендируйте ячейки с 3,5 миллилитрами предварительно охлажденного изоляционного буфера и поместите трубку на магнит на четыре минуты при комнатной температуре. Осторожно аспирируйте супернатант трехмиллилитровой пипеткой. Наконец, повторно суспендируйте ячейки в одном миллилитре предварительно охлажденного буфера FACS.
Чтобы перенести клетки мышам-реципиентам, повторно суспендируйте трансгенно-наивные CD4-положительные CD4-положительные Т-клетки Cbir1 до 5 миллионов клеток на миллилитр в 1x PBS. Согрейте мышей под тепловой лампой и удерживайте мышей с помощью мышиного ограничителя. Внутривенно вводят 200 микролитров клеточной суспензии в хвостовую вену мышей.
После усыпления мыши сделайте примерно сантиметровый вентральный разрез средней линии кожи. Оттяните кожу от брюшной мышечной ткани. Затем делают трехсантиметровый разрез в брюшной мышечной ткани.
Далее определите кочевицу и удалите всю толстую кишку стерильными ножницами и щипцами. Смочите толстую кишку предварительно охлажденным ПБС в чашке для культуры. Разрезайте толстую кишку вдоль и промойте ее предварительно охлажденным PBS.
Отрежьте 1/3 толстой кишки продольно. Поместите полоску толстой кишки в бумажное полотенце просветной стороной, обращенной вверх. Выполняйте швейцарскую прокатку с помощью зубочистки.
Поместите двоеточие швейцарцев в кассету и поместите кассету в 10% буферизованный формалин на 24 часа. Обезвоживание и парафин -встраивание толстой кишки с помощью автоматизированного процессора. Затем вырежьте пятимикрометровые участки ткани на микротоме.
Установите ткань на слайды и выполните окрашивание гематоксилином и эозином. Нокаутированные мыши Rag начали терять вес примерно через три недели после клеточного переноса, и их вес достигал от 80 до 85% от их первоначального веса через шесть недель после переноса клеток. Мыши-реципиенты показали короткую длину толстой кишки через шесть недель после переноса клеток.
Мыши-реципиенты продемонстрировали большую инфильтрацию клеток в кишечной lamina propria через четыре недели после переноса клеток. Они показали потерю бокаловидных клеток и гиперплазию эпителиальных клеток кишечника через пять недель после переноса клеток, а также эрозию слизистой оболочки и воспалительную инфильтрацию клеток в подслизистой оболочке толстой кишки через шесть недель после клеточного переноса. Гистопатологические баллы значительно увеличились с четырех до шести недель.
В то же время не было воспаления у нокаутирующих мышей Rag, получавших только PBS. Используя эту процедуру, уровни цитокинов толстой кишки могут быть определены с помощью ИФА и qPCR.
