炎症性腸疾患、またはIBDは、個人および社会にかなりの健康および財政的負担を課す。この大腸炎モデルは、IBDのメカニズムを研究し、IBDの治療を評価するのに役立ちます。この免疫優性Cbir flagellin T細胞特異的養子移入大腸炎モデルは、腸内細菌抗原がT細胞応答を誘導して大腸炎を誘導する方法についての洞察を提供する。
マウスを安楽死させた後、左腹部約1センチの切開を行い、皮膚を腹筋組織から引き離す。その後、腹筋組織に約3センチの切開を行います。次に、滅菌ハサミと鉗子で脾臓を取り除きます。
5ミリリットルの予め冷却された洗浄緩衝液を含む培養皿に脾臓を置く。2つの滅菌スライドガラスの粗い表面で脾臓を粉砕する。細胞懸濁液を100マイクロメートルのセルストレーナーに通すことによって50ミリリットルの遠沈管に移す。
スライドガラスおよび培養皿を5ミリリットルの予備冷却洗浄緩衝液ですすぎ、洗浄緩衝液をチューブに移す。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、脾臓あたり5ミリリットルの予め加温したトリスアンモニウムクロリド溶解緩衝液で細胞を再懸濁した。室温で10分間インキュベートする。
10ミリリットルの予冷洗浄バッファーをチューブに加える。次いで、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、10ミリリットルの予備冷却単離緩衝液で細胞を再懸濁した。細胞を計数するには、細胞懸濁液とトリパンブルーのそれぞれ10マイクロリットルを徹底的に混合し、10マイクロリットルをスライドにロードする。
次に、自動セルカウンターにスライドを挿入し、生細胞数を取得します。残りの細胞懸濁液を遠心分離し、すべての上清を廃棄する。抗マウスCD4磁性粒子を渦巻き、1000万個の細胞あたり50マイクロリットルの粒子を直接加え、細胞ペレットと十分に混合する。
混合物を摂氏4度で30分間インキュベートする。細胞粒子懸濁液を滅菌収集チューブに移す。3.5ミリリットルの予冷却分離バッファーをチューブに加えます。
チューブを細胞分離磁石の上に置き、室温で8分間置きます。その後、3ミリリットルのトランスファーピペットで上清を慎重に吸引除去する。細胞分離磁石からチューブを取り外します。
次いで、細胞を3.5ミリリットルの予備冷却単離緩衝液で再懸濁し、チューブを磁石上に室温で4分間置いた。上清を3ミリリットルのピペットで慎重に吸引する。最後に、細胞を1ミリリットルの予備冷却FACS緩衝液に再懸濁する。
レシピエントマウスに細胞を移すために、Cbir1 TCR遺伝子導入ナイーブCD4陽性T細胞を1x PBS中の1ミリリットル当たり500万個の細胞に再懸濁する。ヒートランプの下でマウスを温め、マウス拘束器を使用してマウスを拘束する。200マイクロリットルの細胞懸濁液をマウスの尾静脈に静脈内注射する。
マウスを安楽死させた後、約1センチメートルの腹側正中線皮膚切開を行う。腹筋組織から皮膚を引き離す。次に、腹筋組織に3センチメートルの切開を行う。
次に、コエカムを同定し、滅菌ハサミおよび鉗子で結腸全体を除去する。培養皿中で予め冷却したPBSで結腸を濡らす。結腸を縦に切開し、予め冷却したPBSですすいでください。
結腸の1/3を縦に切ります。コロンストリップをペーパータオルに入れ、内腔側を上向きにします。つまようじを使用してスイスローリングを実行します。
結腸スイスをカセットに入れ、カセットを10%緩衝ホルマリンに24時間入れた。脱水し、パラフィンは、自動プロセッサで結腸を埋め込む。次いで、ミクロトーム上の5マイクロメートルの組織切片を切断する。
組織をスライドにマウントし、ヘマトキシリンおよびエオジン染色を行う。Ragノックアウトマウスは、細胞移植後3週間で体重が減り始め、細胞移植後6週間で元の体重の約80〜85%に達しました。レシピエントマウスは、細胞移入後6週間の短い結腸長を示した。
レシピエントマウスは、細胞移入後4週間で腸管固有層におけるより多くの細胞浸潤を実証した。彼らは、細胞移入後5週間の杯細胞喪失および腸上皮細胞過形成、ならびに細胞移入後6週間の結腸の粘膜下における粘膜びらんおよび炎症性細胞浸潤を示した。病理組織学的スコアは4週間から6週間に大幅に増加した。
同時に、PBSのみを投与されたRagノックアウトマウスに炎症はなかった。この手順を用いて、結腸サイトカインレベルは、ELISAおよびqPCRによって決定することができた。
