Малярийные паразиты, такие как комары, которые играют важную роль в распространении болезни. До сих пор невозможно было вырастить малярийных комаров без крови. И чтобы преодолеть это ограничение, наш протокол описывает заменитель крови диеты, которая способна поддерживать размножение комаров в насекомых.
Использование без крови диеты является весьма выгодным по сравнению с кровью. Диета без крови не имеет этических ограничений, как использование человеческой крови, или экспериментальных животных. Замена животных на эксперименты является частью нашей трех R политики.
Заменить, уменьшить, уточнить. Не использование крови снижает затраты, а логистика связана со сбором, хранением и обслуживанием красной крови. Использование искусственных диет может облегчить тестирование молекул антиплазмодия.
До сих пор мы тестировали нашу диету с использованием различных видов анофелей. Во всех из них, диета была хорошо engorged самок и позволило производство яиц и укладки. Мы считаем, что эта диета имеет потенциальное использование для выращивания других видов комаров.
На самом деле, сейчас мы тестируем его на эды, переносчик многих заболеваний, таких как лихорадка денге, вирус Зика или желтая лихорадка. Поддержание anopheles coluzzii yaonde штамм комаров в комнате при 26 градусов по Цельсию, 75% влажности, и под 12 часов до 12 часов светло-темный цикл. Дом комаров, использующих стандартные условия насекомых в одной клетке, чтобы гарантировать спаривание.
Используйте пластиковую пипетку для сбора куколок комаров в небольшой контейнер для воды. Поместите контейнер в клетку комаров, чтобы взрослые комары выйти и спариваться. Обеспечить 10%-глюкозный кормовой раствор в клетке.
Через три дня после появления используйте аспиратор, чтобы собрать необходимое количество самок из клетки в бумажный стакан. Чтобы отличить, самки больше и мужчины имеют более широкий и пернатый хоботок. За день до кормления тропы, удалить 10%глюкозы кормления раствор.
На следующий день, подготовить искусственные жидкие диеты в стерильных условиях в шкафу ламинарного потока в соответствии с рукописью. Добавьте все ингредиенты в пластиковую трубку. Смешайте все ингредиенты тщательно и фильтр с помощью микрофильтра 0,45 микрофильтра.
Заполните стерильный 1 миллилитр шприц оснащен 27 калибровочных поудых иглы со 100 микролитров один миллиграмм на миллилитр гепарина. Затем, анестезировать шесть-восемь недель CD одной самки мышей с кетамином и ксилазином, используя внутри перитонеальный маршрут. Оцените, отображает ли мышь какую-либо мышечную реакцию и реакцию на различные физические раздражители.
Выполните сердечный прокол. Затем соберите кровь из мыши в микротрубку и поддерживать кровь при 37 градусах по Цельсию в водяной бане. Затем соберите около 30 самок комаров из клетки с помощью аспиратора.
Перенесите самок комаров на 500 миллилитров бумажных стаканчиков и накройте тонкой сеткой москитной сетки, чтобы они не могли избежать. Растянуть парафильм мембраны через рот стеклянной подачи, чтобы содержать еду. Нанесите стеклянный колокол искусственного кормления аппарат подключен к пластиковым трубам в верхней части каждой чашки.
Обеспечить постоянный поток воды в цилиндрические трубки и кормушки, чтобы температура внутри хранится на приблизительно 37,5 градусов по Цельсию. Нанесите один миллилитр довоенной жидкой диеты при 37 градусах по Цельсию или свежую кровь мыши в стеклянную кормушки. Кормите комаров в течение 60 минут в темноте при 26 градусах по Цельсию.
После искусственного кормления, холодный обезболить комаров при 20 градусах по Цельсию в течение 30 секунд. Затем поместите комаров в рефрижераторную чашку Петри. Запись числа полностью engorged самки комаров.
Отдельные 30 полностью закосинули самок и посадили их в новую клетку. Теперь поместите увлажненной фильтровальной бумаги в нижней части каждой клетки. Держите комаров на 26 градусов по Цельсию, 75% влажности, и под 12 часов до 12 часов светло-темный цикл с 10%глюкозы ad libitum.
В 96 часов и 120 часов после кормления, подсчитайте яйца с помощью портативного увеличительного стекла. Затопите фильтровальную бумагу дистиллированной водой, чтобы собрать яйца в лотки, наполненные дистиллированной водой. Кормите личинок ежедневно примерно 13 миллиграммами молотой рыбной пищи на поднос.
Удалите мертвых куколок и личинок с пластиковой пипеткой ежедневно. Когда все куколки превратились во взрослых, подсчитайте количество взрослых самцов и самок, зарегистрируйте даты вылупления и смерти и рассчитайте показатели смертности. Чтобы проверить на долговечность, собрать 15 взрослых мужчин и 15 взрослых женщин из поколения F1 каждой группы диеты в бумажный стакан.
Кормите взрослых 10%-глюкозный раствор ad libitum. Используйте пинцет или кисть, чтобы удалить мертвых взрослых ежедневно. Поддерживайте комаров при одинаковой температуре, влажности, условиях светового цикла и режиме кормления сахаром.
Зарегистрируйте даты смерти и рассчитайте продолжительность жизни. Для измерения длины крыла, холодный обезболить пятидневный F1 мужчин и женщин взрослых комаров из каждой группы диеты на 20 градусов по Цельсию в течение 90 секунд. Под стереоскопом аккуратно схватите грудную клетку каждого комара типсами и поместите их вентральную сторону вверх.
Соберите оба крыла с помощью скальпеля, и поместите их на чистый слайд микроскопа, содержащий высушенную каплю монтажной среды для дальнейшего измерения с помощью градуированных окуляр. Измерьте длину крыла с помощью стереоскопа с помощью микрометра. В этом исследовании, производительность самки комаров anopheles кормили на сформулированы богатые искусственной еды и комаров кормили на первоначальной жидкой диеты, или свежие муки крови был сравнен.
Число инфицированных самок комаров, питаемых богатой искусственной едой, на 89% было значительно выше, чем число женщин, питахся кровью, на 56%Поколение комаров F1, питались либо кровью, либо богатой искусственной едой, имели сопоставимую смертность и выживаемость. Вариативность была выше в крови кормили комаров по сравнению с комарами кормили с богатой искусственной еды. С точки зрения размера тела взрослого человека комары F1 anopheles, питаемые богатой искусственной едой, были в пределах ожидаемого диапазона и были похожи на комаров, питаемых кровью насекомых.
На мой взгляд, очень важно правильно собрать фидееры с парафильмом, чтобы избежать его разрыва. Если мембрана не очень хорошо прикреплена к стеклянной кормушки, вы можете потерять еду и, вероятно, потерять некоторые из комаров, поскольку они могут быть покрыты едой и умереть. Мы хотели бы выполнить двойной выбор притяжения анализа, например, с помощью олфактометра, чтобы мы могли на самом деле оценить, если наши женщины больше привлекают к искусственной диете или крови.
Кроме того, мы сейчас лиофилизации искусственной диеты и изучения его стабильности среди различных температур в течение длительного времени. Помимо очевидных улучшений стабильности и хранения, что мы работаем, долгосрочное использование диеты на комаров фитнес и физиологии должны быть исследованы. Я считаю, что производство анофелей без крови будет способствовать чрезвычайно векторных исследований и внедрения средств контроля, которые зависят от большого числа комаров.
