Этот подход, основанный на происхождении, позволяет проводить протеомный анализ важных событий развития с пространственным и временным разрешением в эмбрионе позвоночных, передавая информацию, которая была бы недоступна при измерениях всего эмбриона. Этот подход может быть легко распространен на изучение белков, метаболитов и транскриптов из различных эмбриональных клеток, поскольку они дифференцируются во время развития. Этот метод может продвинуть наше понимание молекулярных механизмов, которые контролируют нормальное развитие и развитие заболевания, включая механизмы индукции тканей и определения судьбы клеток во время раннего развития.
Используйте волосяную петлю, чтобы направить каждый эмбрион в лунку, и аккуратно расположите их так, чтобы интересующая клетка находилась под прямым углом к микроигле. Следуйте картам судьбы тканей Xenopus laevis, чтобы идентифицировать клетку-предшественник интересующей линии. Используйте два заостренных щипца, чтобы аккуратно удалить вителлиновую мембрану, окружающую эмбрион.
Изолируют отдельные клетки от эмбриона путем ручного вскрытия с помощью щипцов. Начните с установки инъекционной иглы, содержащей раствор индикатора происхождения. Установите иглу для микроинъекций в держатель микропипетки, управляемый многоосевым микроманипулятором.
Подсоедините держатель микропипетки к микроинжектору и заполните иглу индикатором происхождения, приложив отрицательное давление. Откалибруйте иглу и отрегулируйте размер наконечника иглы и время впрыска, чтобы доставить примерно один нанолитр раствора индикатора происхождения, измеренного в минеральном масле. Убедитесь, что размер вводимой капли точный, и при необходимости отрегулируйте настройки инжектора.
Залейте глиняную чашку для микроинъекций раствором 3%fCAL и перенесите примерно 10 эмбрионов в глиняную форму с помощью пипетки для переноса. Вводите в интересующие клетки примерно один нанолитр флуоресцентного декстрана или 200 пикограмм мРНК GFP. С помощью стереомикроскопа подтвердите успешность маркировки клеток.
Убедитесь, что вводится только предполагаемая клетка. Откажитесь от эмбрионов, содержащих поврежденные или неправильно помеченные клетки, в соответствии с институциональной политикой. Перенесите инъецированные эмбрионы в чашку Петри, содержащую 0,5-кратный раствор Штейнберга.
Культивируйте их при температуре от 14 до 25 градусов по Цельсию, пока они не достигнут желаемой стадии развития. Перенесите от трех до пяти эмбрионов в чашку с агаром, содержащую 0,2x раствор Штейнберга для микровскрытия. Используйте щипцы, чтобы отделить меченый клон от эмбриона.
Соберите рассеченную ткань с помощью пипетки объемом от 0,5 до 10 микролитров и поместите ее в файл для микроцентрифуги. Используя пипетку, аспирируйте среду, окружающую собранную ткань, чтобы ограничить содержание солей в образце, чтобы избежать помех анализу HRMS. Немедленно заморозьте изолированные клетки, поместив флакон с образцом на сухой лед или жидкий азот.
Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до масс-спектрометрического анализа. Для обработки образца одной клетки с помощью CE денатурируют белки, нагревая образец до 60 градусов Цельсия в течение примерно 15 минут. Затем уравновесьте образец до комнатной температуры в течение пяти минут и добавьте трипсин в образцы для разложения.
Для анализа с помощью NanoLC лизируют до пяти рассеченных тканей в 50 микролитрах лизисного буфера. Облегчите процесс, пипетируя образец вверх и вниз. Чтобы обработать рассеченные ткани, инкубируйте лизат при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
Затем гранулируйте клеточный мусор и желтковые тромбоциты при четырех градусах Цельсия путем центрирования при 4 500 RCF. Перенесите надосадочную жидкость в чистый флакон микроцентрифуги и добавьте 10% SDS, чтобы получить окончательную концентрацию 1% SDS в лизате. Для тканей добавьте 0,5 молярного дитиотреитола к лизату, чтобы получить конечную концентрацию примерно 25 миллимоляров.
Затем инкубируйте лизат в течение 30 минут при 60 градусах Цельсия, чтобы химически восстановить дисульфидные связи в белках. Добавьте 0,5 моляра йодоацетамида для получения конечной концентрации примерно 75 миллимоляр в лизате и инкубируйте смесь в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Добавьте 0,5 моляра дитиотреитола так же, как и исходный объем, чтобы погасить реагенты, оставшиеся от реакции алкилирования.
Осаждают белки в ацетоне в течение ночи, как описано в текстовом протоколе, и восстанавливают в 0,5 молярного бикарбоната аммония. Добавьте трипсин для разложения образца и инкубируйте флаконы при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы разделить пептиды с помощью КЭ, восстановите белок, расщепленный в одном-двух микролитрах растворителя образца.
Встряхните смешанный образец и центрифузию при 10 000 RCF в течение двух минут при четырех градусах Цельсия для гранулирования остатков клеток. Инициализируйте прибор CE-ESI, промыв капилляр CE с помощью BGE. Поместите один микролитр образца во флакон с образцом и введите от одного до 10 нанолитров образца в капилляр разделения CE с помощью гидродинамической инъекции.
Перенесите входной конец разделительного капилляра CE в BGE. Начните электрофоретическую сепарацию, постепенно увеличивая напряжение разделения CE от заземления. Потенциалы от 20 до 28 киловольт при токе ниже 10 микроампер обеспечивают стабильную и воспроизводимую инструментальную производительность для анализа.
Чтобы разделить с помощью Nano LC, повторно суспендируйте образец пептида в подвижной фазе A. Концентрация образца и объем впрыска зависят от доступной системы LC и колонки. Переложите образец во флакон LC. Загрузите приблизительно 200 нанограммов в два микрограмма пептидного образца в аналитическую колонку C18 и разделите пептиды со скоростью потока 300 нанолитров в минуту с использованием градиентного элюирования, как описано в текстовой рукописи.
С помощью камеры проверьте поток жидкости через электрораспылитель и визуально осмотрите установку на предмет возможных утечек. Получите события масс-спектрометрии и секвенируйте пептиды, как описано в текстовой рукописи. Были обнаружены трансляционные различия генов между клетками D11, рассеченными из разных эмбрионов с помощью CE-ESI-HRMS.
Меченные линией рассеченные клеточные клоны были проанализированы с помощью LC-HRMS. Анализ путей белков показал повышенную трансляцию белка и энергетический обмен в органайзере Шпемана с нейроэктодермой. Продеум нейроэктодермы был обогащен белками, связанными с ядерным транспортом белкового груза в клетке, что, вероятно, указывает на последующие события после передачи сигналов.
Анализ обогащения молекулярных функций показал усиление регуляции инициации трансляции, связывания РНК и связывания протеасомного комплекса, что указывает на роль динамического обновления белка, развивающего организатора Шпемана. Отбирайте только стереотипные эмбрионы для этого протокола, чтобы улучшить воспроизводимость и интерпретацию результатов. Рассеченную ткань следует переложить во флакон и немедленно заморозить, содержа как можно меньше буфера среды, чтобы свести к минимуму загрязнение буферными солями.
Этот подход позволил нам изучить динамику белка в идентифицированных клетках и клеточных линиях живых эмбрионов. Новая информация, которую мы получили о пространственно-временной продукции важных белков в развивающихся тканях, позволила нам разработать целевые эксперименты для оценки их биологической функции.
