이 계통 유도 접근 방식은 척추동물 배아 내의 공간적 및 시간적 분해능을 통해 중요한 발달 사건의 단백질체 분석을 가능하게 하여 전체 배아 측정을 통해 접근할 수 없는 정보를 전달합니다. 이 접근법은 발달 중에 분화되는 다양한 배아 세포의 단백질, 대사 산물 및 전사체를 연구하기 위해 쉽게 확장될 수 있습니다. 이 방법은 초기 발달 동안 조직 유도 및 세포 운명 헌신 메커니즘을 포함하여 정상 및 질병 발달을 제어하는 분자 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
헤어 루프를 사용하여 각 배아를 우물로 안내하고 관심 대상 세포가 마이크로니들과 직각이 되도록 부드럽게 배치합니다. xenopus laevis 조직 운명 지도를 따라 관심 계통의 전구체 세포를 식별합니다. 두 개의 날카로운 집게를 사용하여 배아를 둘러싼 vitelline 막을 부드럽게 제거합니다.
집게를 사용하여 수동 해부로 배아에서 단일 세포를 분리합니다. 먼저 계보 추적 용액이 들어 있는 주사 바늘을 설정합니다. 미세 주입 바늘을 다축 마이크로 매니퓰레이터로 제어되는 마이크로 피펫 홀더에 장착합니다.
마이크로 피펫 홀더를 마이크로 인젝터에 연결하고 부압을 가하여 리니지 트레이서로 바늘을 채웁니다. 바늘을 보정하고 바늘 끝의 크기와 주입 시간을 조정하여 미네랄 오일에서 측정된 약 1나노리터의 계보 추적 용액을 전달합니다. 주입되는 액적 크기가 정확한지 확인하고 필요한 경우 인젝터 설정을 조정합니다.
미세주입 점토 접시에 3%fCAL 용액을 채우고 이식 피펫을 사용하여 약 10개의 배아를 점토 접시에 옮깁니다. 관심 세포에 약 1나노리터의 형광 덱스트란 또는 200피코그램의 GFP mRNA를 주입합니다. 실체 현미경을 사용하여 세포 라벨링의 성공 여부를 확인합니다.
의도한 세포만 주입되었는지 확인합니다. 손상되었거나 잘못 라벨링된 세포가 포함된 배아는 제도적 정책에 따라 폐기합니다. 주입된 배아를 0.5x Steinberg 용액이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
원하는 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 14도에서 25도 사이에서 배양하십시오. 3-5개의 배아를 미세 해부를 위해 0.2x Steinberg 용액이 들어 있는 한천 접시에 옮깁니다. 집게를 사용하여 배아에서 표지된 클론을 해부합니다.
0.5-10 마이크로 리터 피펫으로 해부 된 조직을 수집하여 마이크로 원심 분리기 파일에 넣습니다. 피펫을 사용하여 수집된 조직을 둘러싼 배지를 흡인하여 HRMS 분석에 방해가 되지 않도록 시료의 염분을 제한합니다. 샘플 바이알을 드라이아이스 또는 액체 질소에 올려 놓아 분리된 세포를 즉시 동결합니다.
질량 분석 분석이 있을 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. CE에 의한 단일 세포 샘플 처리의 경우 샘플을 약 15분 동안 섭씨 60도로 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 평형화하고 소화를 위해 샘플에 트립신을 첨가합니다.
NanoLC에 의한 분석을 위해 50마이크로리터의 용해 완충액에서 최대 5개의 해부된 조직을 용해합니다. 시료를 위아래로 피펫팅하여 공정을 용이하게 합니다. 해부된 조직을 처리하기 위해 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.
그런 다음 세포 파편과 노른자 혈소판을 섭씨 4도에서 4, 500 RCF에서 중심화하여 펠릿화합니다. 상청액을 깨끗한 마이크로 원심분리기 바이알에 옮기고 10% SDS를 첨가하여 용해물에서 1% SDS의 최종 농도를 얻습니다. 조직의 경우 용해물에 0.5몰 디티오트레이톨을 첨가하여 약 25밀리몰의 최종 농도를 얻습니다.
그런 다음 용해물을 섭씨 60도에서 30분 동안 배양하여 단백질의 이황화 결합을 화학적으로 감소시킵니다. 0.5몰 요오도아세트아미드를 첨가하여 용해물에 약 75밀리몰의 최종 농도를 얻고 혼합물을 실온에서 암실에서 15분 동안 인큐베이션합니다. 초기 부피와 동일한 0.5 몰의 디티오트레이톨을 첨가하여 알킬화 반응에서 남은 반응물을 소멸시킵니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하룻밤 동안 아세톤에 단백질을 침전시키고 0.5몰 중탄산암모늄으로 재구성합니다. 시료 분해를 위해 트립신을 첨가하고 바이알을 섭씨 37도에서 배양합니다. CE를 사용하여 펩타이드를 분리하기 위해, 1 내지 2 마이크로리터의 샘플 용매에서 분해된 단백질을 재구성한다.
혼합된 샘플을 섭씨 4도에서 2분 동안 10, 000 RCF에서 원심 융합하여 세포 파편을 펠렛화합니다. CE 모세관을 BGE로 세척하여 CE-ESI 기기를 초기화합니다. 1 마이크로 리터의 샘플을 샘플 바이알에 넣고 유체 역학 주입에 의해 1-10 나노 리터의 샘플을 CE 분리 모세관에 주입합니다.
CE 분리 모세관의 입구 끝을 BGE로 옮깁니다. 접지에서 CE 분리 전압을 점진적으로 램핑하여 전기 영동 분리를 시작합니다. 10 마이크로 암페어 미만의 전류에서 20 - 28 킬로볼트의 전위는 분석을 위한 안정적이고 재현 가능한 기기 성능을 보장합니다.
Nano LC를 사용하여 분리하려면 이동상 A.The 샘플의 농도와 주입 부피가 사용 가능한 LC 시스템 및 컬럼에 따라 달라지므로 펩타이드 샘플을 다시 중단합니다. 샘플을 LC 바이알에 옮깁니다. 약 200 나노그램에서 2 마이크로 그램의 펩타이드 샘플을 C18 분석 컬럼에로드하고 텍스트 원고에 설명 된대로 그래디언트 용출을 사용하여 분당 300 나노 리터의 유속으로 펩타이드를 분리합니다.
카메라를 사용하여 전기 스프레이 방출기를 통한 액체 흐름을 확인하고 누출 가능성이 있는지 설정을 육안으로 검사합니다. 질량 분석 이벤트를 획득하고 텍스트 원고에 설명된 대로 펩타이드를 시퀀싱합니다. CE-ESI-HRMS를 사용하여 상이한 배아에서 해부된 D11 세포 간에 유전자 번역 차이가 검출되었습니다.
계통-표지된 해부된 세포 클론을 LC-HRMS에 의해 분석하였다. 단백질의 경로 분석은 신경외배엽이 있는 Spemann의 조직자에서 상향 조절된 단백질 번역 및 에너지 대사를 보여주었습니다. 신경 외배엽 prodeum은 세포 내 단백질 화물의 핵 수송과 관련된 단백질이 풍부했으며, 이는 신호 전달 후 다운스트림 사건을 나타낼 가능성이 있습니다.
분자 기능의 농축 분석은 번역 개시, RNA 결합 및 프로테아좀 복합체의 결합에서 상향 조절을 나타내었으며, 이는 Spemann의 조직자를 개발하는 동적 단백질 회전율에 대한 역할을 시사합니다. 이 프로토콜에 대해 고정형 배아만 선택하여 재현성과 결과 해석을 개선합니다. 해부된 조직은 바이알에 옮겨 완충액염으로 인한 오염을 최소화하기 위해 가능한 한 최소한의 배지 완충액을 함유한 즉시 냉동해야 합니다.
이 접근법을 통해 우리는 확인된 세포의 단백질 역학과 살아있는 배아의 세포 계통을 연구할 수 있었습니다. 발달 중인 조직에서 중요한 단백질의 공간적 시간 생산에 대해 얻은 새로운 정보를 통해 생물학적 기능을 평가하기 위한 표적 실험을 설계할 수 있었습니다.
