Bu soy rehberliğindeki yaklaşım, omurgalı embriyo içindeki uzamsal ve zamansal çözünürlükle önemli gelişimsel olayların proteomik analizini sağlar ve tüm embriyo ölçümleriyle erişilemeyecek bilgileri verir. Bu yaklaşım, gelişim sırasında farklılaştıkça farklı embriyonik hücrelerden proteinleri, metabolitleri ve transkriptleri incelemek için kolayca genişletilebilir. Bu yöntem, erken gelişim sırasında doku indüksiyonu ve hücre kaderi taahhüdü mekanizmaları da dahil olmak üzere normal ve hastalık gelişimini kontrol eden moleküler mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Her embriyoyu bir kuyuya yönlendirmek için bir saç halkası kullanın ve hedeflenen ilgili hücrenin mikroiğneye doğru açıda olması için yavaşça konumlandırın. İlgilenilen soyun öncü hücresini tanımlamak için xenopus laevis doku kader haritalarını izleyin. Embriyoyu çevreleyen vitelin zarını nazikçe çıkarmak için iki keskinleştirilmiş forseps kullanın.
Forseps kullanarak manuel diseksiyon ile tek hücreleri embriyodan izole edin. Soy izleyici çözeltisini içeren enjeksiyon iğnesini ayarlayarak başlayın. Mikroenjeksiyon iğnesini, çok eksenli bir mikro manipülatör tarafından kontrol edilen bir mikro pipet tutucuya monte edin.
Mikro pipet tutucuyu bir mikro enjektöre bağlayın ve negatif basınç uygulayarak iğneyi soy izleyici ile doldurun. İğneyi kalibre edin ve mineral yağda ölçülen soy izleyici çözeltisinin yaklaşık bir nanolitresini vermek için iğne ucunun boyutunu ve enjeksiyon süresini ayarlayın. Enjekte edilen damlacık boyutunun doğru olduğundan emin olun ve gerekirse enjektör ayarlarını yapın.
Mikroenjeksiyon kil kabını %3'lük bir fCAL çözeltisi ile doldurun ve bir transfer pipeti kullanarak yaklaşık 10 embriyoyu kil kabına aktarın. İlgili hücrelere yaklaşık bir nanolitre floresan dekstran veya 200 pikogram GFP mRNA enjekte edin. Bir stereo mikroskop kullanarak, hücre etiketlemenin başarısını onaylayın.
Yalnızca amaçlanan hücrenin enjekte edildiğinden emin olun. Kurumsal politikalara uyarak yaralı veya yanlış etiketlenmiş hücreler içeren embriyoları atın. Enjekte edilen embriyoları 0.5x Steinberg çözeltisi içeren bir petri kabına aktarın.
İstenilen gelişim aşamasına ulaşana kadar onları 14 ila 25 santigrat derece arasında kültürleyin. Üç ila beş embriyoyu, mikro diseksiyonlar için 0.2x Steinberg çözeltisi içeren bir agar kabına aktarın. Etiketli klonu embriyodan diseke etmek için forseps kullanın.
Disseke edilmiş dokuyu 0,5 ila 10 mikrolitrelik bir pipetle toplayın ve bir mikro santrifüj dosyasına koyun. Bir pipet kullanarak, HRMS analizine müdahale edilmesini önlemek için numunedeki tuzları sınırlamak üzere toplanan dokuyu çevreleyen ortamı aspire edin. Numune şişesini kuru buz veya sıvı azot üzerine yerleştirerek izole edilmiş hücreleri derhal dondurun.
Kütle spektrometresi analizine kadar numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. CE ile tek hücreli numune işleme için, numuneyi yaklaşık 15 dakika boyunca 60 santigrat dereceye ısıtarak proteinleri denatüre edin. Daha sonra numuneyi beş dakika boyunca oda sıcaklığına dengeleyin ve sindirim için numunelere tripsin ekleyin.
NanoLC ile analiz için, 50 mikrolitre lizis tamponunda beş adede kadar disseke dokuyu lize edin. Numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek işlemi kolaylaştırın. Disseke edilmiş dokuları işlemek için, lizatı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra hücre kalıntılarını ve yumurta sarısı trombositlerini 4.500 RCF'de merkezleştirme yoluyla dört santigrat derecede peletleyin. Süpernatantı temiz bir mikro santrifüj şişesine aktarın ve lizatta% 1'lik SDS'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için% 10 SDS ekleyin. Dokular için, yaklaşık 25 milimolar'lık nihai bir konsantrasyon elde etmek için lizata 0.5 molar ditiyotreitol ekleyin.
Daha sonra, proteinlerdeki disülfit bağlarını kimyasal olarak azaltmak için lizatı 60 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Lizatta yaklaşık 75 milimolar'ın nihai konsantrasyonunu elde etmek için 0.5 molar iyodoasetamid ekleyin ve karışımı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Alkilasyon reaksiyonundan kalan reaktanları söndürmek için başlangıç hacmiyle aynı 0.5 molar ditiyotreitol ekleyin.
Metin protokolünde açıklandığı gibi gece boyunca asetondaki proteinleri çökeltin ve 0.5 molar amonyum bikarbonatta yeniden oluşturun. Numune sindirimi için tripsin ekleyin ve şişeleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Peptitleri CE kullanarak ayırmak için, numune çözücüsünün bir ila iki mikrolitresinde sindirilen proteini yeniden oluşturun.
Karışık numuneyi ve merkezcilleştirmeyi 10.000 RCF'de dört santigrat derecede iki dakika boyunca pelet hücresi kalıntılarına vorteks. CE kılcal damarını BGE ile yıkayarak CE-ESI cihazını başlatın. Numune şişesine bir mikrolitre numune yerleştirin ve numunenin bir ila 10 nanolitresini hidrodinamik enjeksiyonla CE ayırma kılcal damarına enjekte edin.
CE ayırma kılcal damarının giriş ucunu BGE'ye aktarın. CE ayırma voltajını toprak topraklamasından kademeli olarak artırarak elektroforetik ayırmaya başlayın. 10 mikro amperin altında bir akımla 20 ila 28 kilovoltluk potansiyeller, analiz için istikrarlı ve tekrarlanabilir enstrümantal performans sağlar.
Nano LC kullanarak ayırmak için, peptid numunesini mobil faz A'da yeniden askıya alın.Numunenin konsantrasyonu ve enjeksiyon hacmi, mevcut LC sistemine ve kolonuna bağlıdır. Numuneyi bir LC şişesine aktarın. C18 analitik sütununa yaklaşık 200 nanogram ila iki mikrogram peptit örneği yükleyin ve peptitleri, metin makalesinde açıklandığı gibi gradyan elüsyonunu kullanarak dakikada 300 nanolitrelik bir akış hızında ayırın.
Bir kamera kullanarak, elektro sprey yayıcıdan sıvı akışını kontrol edin ve kurulumu olası sızıntılara karşı görsel olarak inceleyin. Kütle spektrometresi olaylarını elde edin ve peptitleri metin makalesinde açıklandığı gibi sıralayın. CE-ESI-HRMS kullanılarak farklı embriyolardan diseke edilen D11 hücreleri arasında gen translasyonel farklılıklar tespit edildi.
Soy etiketli disseke hücre klonları LC-HRMS ile analiz edildi. Proteinlerin yol analizi, Spemann'ın organizatöründe nöroektoderm ile birlikte düzenlenmiş protein translasyonunu ve enerji metabolizmasını gösterdi. Nöroektoderm prodeumu, hücredeki protein yükünün nükleer taşınması ile ilişkili proteinlerle zenginleştirildi ve muhtemelen sinyallemeyi takiben aşağı akış olaylarını gösterdi.
Moleküler fonksiyonların zenginleştirme analizi, translasyon başlatma, RNA bağlanma ve proteazom kompleksinin bağlanmasında yukarı regülasyonu gösterdi ve Spemann'ın organizatörünü geliştiren dinamik protein döngüsü için bir rol düşündürdü. Tekrarlanabilirliği ve sonuç yorumlamasını iyileştirmek için bu protokol için sadece basmakalıp embriyoları seçin. Diseke edilmiş doku bir şişeye aktarılmalı ve tampon tuzlarından kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirmek için mümkün olduğunca az ortam tamponu içeren derhal dondurulmalıdır.
Bu yaklaşım, tanımlanmış hücrelerdeki protein dinamiklerini ve canlı embriyolardaki hücre soylarını incelememizi sağlamıştır. Gelişmekte olan dokulardaki önemli proteinlerin mekansal zamansal üretimi hakkında elde ettiğimiz yeni bilgiler, biyolojik işlevlerini değerlendirmek için hedefli deneyler tasarlamamızı sağlamıştır.
