Этот метод может быть использован для облегчения визуализации очень тонких процессов астроцитов для оценки астроцитов нейрональных взаимодействий при синапсе во время болезни и устойчивых состояний. Этот метод также может быть применен в любой модели мыши, популяции клеток или области мозга. Чтобы подготовить острый электрод с соответствующим сопротивлением, потяните борозиликатное стекло одноствольного электрода с нитью на шкиве микропайпта.
Храните вытащил электродов в закрытом контейнере, чтобы предотвратить пыль от входа в советы и держать электроды подняты со дна коробки, чтобы предотвратить советы от разрушения. Чтобы заполнить электрод раствором люцифера желтого красителя, поместите электрод в вертикальное положение с наконечником вниз, и пипетку от одного до двух микролитров люцифера желтого раствора в задней части электрода. Подождите от пяти до 10 минут для решения, чтобы перейти к кончику через капиллярное действие, прежде чем мягко обеспечения заполнены электрода в держатель электрода подключен к манипулятору с серебряной проволокой держатель электрода в контакте с люцифера желтый внутри электрода.
Для теста на выброс красителя аккуратно поместите слегка фиксированный ломтик мозга в стеклянную нижнюю тарелку, наполненную 0,1 молярным PBS при комнатной температуре, и удерживайте ломтик на месте с платиновой арфой с нейлоновыми струнами. Подключите электрод к источнику напряжения и поместите наземный электрод в ванну, содержащую срез мозга. Переместите цель конфокального микроскопа в область интереса мозга и опустите электрод в раствор с помощью объектива погружения воды 10X, перемещая электрод в центр поля зрения.
При ярко-полевом освещении внимательно изучите электрод с помощью объектива погружения в воду 40X, чтобы электрод был ясным и без мусора или пузырьков. Переключитесь на конфокальные лазерные сканирующие микроскопии с помощью 488-нанометрового лазера. Включите стимулятор на 12 вольт, чтобы проверить выброс красителя.
Вокруг кончика электрода должно быть видно большое облако флуоресцентного красителя. Затем, под ярким полем медленно опустите электрод к ломтику, останавливаясь чуть выше поверхности. Чтобы заполнить астроцит, представляющий интерес, ионтофорезом, используйте инфракрасный дифференциальный интерференционный контраст для идентификации астроцитов с удлиненной овальной соматой диаметром около 10 микрометров, на 40-50 микрометров ниже поверхности среза.
Это слой излучения гиппокампа непосредственно под слоем пирамидальных клеток. По мере того как мы двигаем через ткань, мы можем увидеть кровеносные сосуды, нейроны, астроциты, и другие типы клетки. После того, как астроцит был выбран, переместить клетку в центр поля зрения и медленно опустите кончик электрода в ломтик, навигация по ткани, пока электрод находится на той же равнине, как тело клетки.
Как только клеточное тело астроцита хорошо видно и обрисовано, медленно и осторожно продвигает электрод вперед, перемещая электрод до тех пор, пока кончик не пронзит сому клетки. Перемещение фокус цели медленно вверх и вниз, чтобы отметить, если электрод находится внутри сомы. Как только кончик электрода находится внутри клетки, включите стимулятор на 0,5 к одному вольту, чтобы непрерывно выбрасывать ток в клетку.
Используя конфокальный микроскоп, наблюдайте за пленкой клетки, увеличивая цифровой зум, чтобы визуализировать детали клетки и убедиться, что кончик электрода виден внутри клетки по мере необходимости. Подождите около 15 минут, пока не появятся более тонкие ветви и процессы, прежде чем выключить напряжение и аккуратно вывести кончик электрода из клетки. Чтобы изображение заполненной ячейки, подождите от 15 до 20 минут для ячейки, чтобы вернуться к своей первоначальной форме, прежде чем настроить настройки на конфокальный микроскоп, чтобы убедиться, что тонкие ветви и процессы появляются определены в соответствии с целью 40X.
Настройка стека q с размером шага 0,3 микрометра, перемещение цели во время изображения до тех пор, пока нет сигнала от ячейки и установить этот шаг в качестве верхней. Затем смести цель вниз, фокусировка через ячейку, пока нет сигнала и установить этот шаг в качестве дна. После завершения визуализации проверьте электрод на выброс красителя.
Если появляется большое облако красителя, электрод может быть использован для следующего среза. В противном случае замените электрод. Создавая проекцию максимальной интенсивности, можно наблюдать детальное представление о структуре астроцита в его домене.
ЧетырехМ величина X зум в астроцит показывает максимальную интенсивность проекции одной крупной ветви, несколько вторичных ветвей, а также распределение окружающих ветвей и листовок. Здесь показано исходное изображение астроцита CA1. В этих последующих изображениях реконструируются клеточное тело, основные ветви, процессы и объем территории, окруженный астроцитом.
После того, как были созданы реконструкции, были количественно оценены объемы сомы, всей ячейки и территории. И количество крупных филиалов было подсчитано. Как цитоскелетный белок, который маркирует промежуточные нити астроцитов выражается в клеточной соме, основных ветвях и некоторых вторичных ветвях астроцитов, но не в более тонких ветвях и процессах.
В этом репрезентативном анализе не было обнаружено существенных различий в количестве первичных ветвей, помеченных глиальным фибриллярдным кислым белком, и в тех, которые визуализированы люцифер-желтым цветом. Кроме того, площадь клеток и объем астроцита, помеченного глиальным фибриллярным кислым белком, были значительно меньше площади и объема, визуализированы люциферным желтым цветом, что продемонстрировано, что глиальный фибриллярный кислый белок является надежным маркером для маркировки основных ветвей, но не полезен для определения общей площади или объема клетки. Количество красителя, высвобождаемого из наконечника электрода, зависит от сопротивления электрода, которое должно быть достаточно высоким, чтобы можно было выбрасывать устойчивый поток красителя.
Будущие исследования могут исследовать различные компоненты структуры астроцитов с помощью световой микроскопии супер разрешения или иммуногистохимического анализа экспрессии конкретных белков в структуре астроцитов.
