Модель ex vivo является полезным методом оценки влияния различных физиологических вмешательств и фармакологических соединений и поглощения глюкозы мышцами. Этот метод позволяет точно оценить поглощение глюкозы в изолированных скелетных мышцах мыши при отсутствии смешанных факторов, которые могут мешать интактной модели животных. Прежде чем начать эксперимент, включите интегрированную систему биографии мышечной полосы и разогрейте камеры до 30 градусов по Цельсию.
Откройте программное обеспечение для сбора данных и откалибруйте принудительные преобразователи для обеспечения сопоставимости между наборами данных. Добавьте четыре миллилитра предварительно нагретой базальной инкубационной среды 30 градусов цельсия в каждую инкубационную камеру и убедитесь, что среда непрерывно насыщается кислородом 95% кислорода и 5% углекислого газа. Поместите мышь в положение лежа на лотке для рассечения и подтвердите отсутствие реакции на педальный рефлекс.
Затем прижмите одну переднюю лапу иглой. Используйте ножницы, чтобы удалить кожу с голени, пока не будут видны ахиллово сухожилие и коленный сустав. Для рассечения камбаловидной мышцы прикрепите одну шовную петлю диаметром 0,4 сантиметра, подготовленную из 16-сантиметрового нерассасывающегося хирургического нейлонового куска шва, к ахиллову сухожилию и закрепите щипцы к ахиллову сухожилию дистально к петле.
Отрежьте, чтобы освободить камбаловидные и икроножные мышцы от лапы и осторожно проведите щипцами по мыши, чтобы обнажить камбаловидную мышцу. Зажмите щипцы и поместите вторую шовную петлю вокруг проксимального сухожилия камбаловидной мышцы. Отрежьте проксимальное сухожилие и рассекните камбалу, включая две прикрепленные шовные петли, свободные от икроножной мышцы.
После сбора используйте петли, чтобы быстро прикрепить камбаловидную мышцу к соответствующим крючкам в одной из инкубационных камер. Используйте щипцы для удаления фасции, покрывающей переднюю мышцу большеберцовой кости. Дистальные сухожилия большеберцовой передней или EDL мышц должны быть прозрачными белыми, видимыми и отделенными друг от друга.
Отрежьте дистиллированное сухожилие передней мышцы большеберцовой кости и рассекните мышцу. Используйте щипцы, чтобы мягко освободить мышцу EDL из окружающих тканей, оставив мышцу нетронутой, не разрезая сухожилия. Поместите отдельные шовные петли вокруг дистилляционных и проксимальных сухожилий EDL.
Когда петли будут размещены, отрежьте сухожилия, чтобы освободить мышцу EDL с прикрепленными шовными петлями и быстро прикрепите петли к крючкам во второй инкубационной камере. Затем отрегулируйте напряжение каждой мышцы в состоянии покоя примерно до пяти миллиньютонов и позвольте мышцам уравновеситься в среде в течение не менее 10 минут перед началом эксперимента. Чтобы измерить стимулированное инсулином поглощение глюкозы, замените базальную инкубационную среду в камерах инкубационной средой без инсулина, субмаксимально эффективной концентрацией инсулина или максимально эффективной концентрацией инсулина для 20-минутной инкубации.
В конце периода стимуляции заменить инкубационную среду инкубационной средой поглощения глюкозы, содержащей одинаковую концентрацию инсулина, в течение 10 минут инкубации. В конце инкубации поглощения глюкозы осторожно вынимают мышцы из инкубационных камер и промывают образцы в ледяной базальной инкубационной среде. После умывания быстро высушите мышцы на фильтровальной бумаге и заморозьте ткань без шовных петель в жидком азоте.
Затем соберите 100 микролитров инкубационной среды поглощения глюкозы из каждой камеры для хранения 20 градусов цельсия и анализа поглощения глюкозы в мышцах. Чтобы измерить сокращение, стимулируемое поглощением глюкозы, поместите платиновые электроды в центре и по обе стороны мышц в инкубационных камерах и инициируйте сокращение мышц сразу после замены базальной инкубационной среды инкубационной средой инкубационной среды поглощения глюкозы. Запишите вынужденную выработку из каждой инкубированной мышцы.
Через 10 минут осторожно соберите и заморозьте мышцы, как показано, сохраняя 100 микролитровых аликвот инкубационной среды поглощения глюкозы из каждой камеры для анализа поглощения глюкозы мышцами, как показано. Чтобы определить миоцеллюлярную сигнализацию с помощью анализа вестерн-блоттинга в том же наборе мышечных образцов, гомогенизируйте каждый замороженный образец мышцы в 400 микролитрах буфера гомогенизации ледяного холода и вращайте конец образца за концом в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Затем соберите ликат путем центробежной обработки и измерьте количество интересующего белка в каждом образце поддона в соответствии со стандартными протоколами анализа вестерн-блоттинга.
Чтобы измерить поглощение глюкозы в каждом образце, добавляют 150 микролитров супернатанта из каждого образца и 25 микролитров инкубационной среды поглощения глюкозы из соответствующих инкубационных камер для разделения жидких сцинтилляционных флаконов, содержащих три миллилитра жидкой сцинтилляционной жидкости на флакон. Затем загрузите флаконы на жидкостный сцинтилляционный счетчик и измерьте радиоактивность двух дезоксиглюкоз и маннитола в соответствии с рекомендациями производителя. В этом репрезентативном анализе показатели поглощения базальной глюкозы были сходны между камбаловидными и ЭДЛ-мышцами, выделенными у самок мышей.
Поглощение глюкозы увеличивалось в камбаловидных и ЭДЛ-мышцах в ответ как на субмаксимально, так и на максимально эффективные концентрации инсулина. Кроме того, как субмаксимальное, так и максимальное поглощение глюкозы, стимулируемое инсулином, было значительно выше в камбаловидной мышце. Напротив, поглощение глюкозы, вызванное сокращением, было значительно выше в EDL по сравнению с камбаловидной мышцей.
Здесь может наблюдаться максимальная мышечная сила, вырабатываемая в камбаловидных мышцах и мышцах ЭДЛ в течение 10-минутного периода стимуляции. Как и ожидалось, мышца EDL генерировала больше силы в течение начальной части периода стимуляции, за которой следовало быстрое снижение позже в период стимуляции. Субмаксимальные и максимальные концентрации инсулина индуцировали увеличение фосфорилирования Akt треонина 308 и TBC1D4 серина 588, в то время как сокращение индуцировало увеличение фосфорилирования ampk альфа-треонина 172 и серина ACC 212.
Ни инсулин, ни сокращение не привели к изменению общего содержания белка. Прежде чем пытаться измерить поглощение глюкозы в изолированных мышцах мыши, жизненно важно тщательно практиковать рассечение камбалы и мышц EDL. После оценки поглощения глюкозы мышцами оставшийся лизат мышечного белка может быть использован для дополнительного биохимического анализа, который может прояснить наблюдаемые изменения в скорости поглощения глюкозы.
