Этот протокол позволяет маркировать белки специфическим для типа клеток способом. Это первая техника, которая предлагает такую возможность, и это можно сделать in vitro или in vivo. Основным преимуществом методики является то, что меченые белки типа клеток могут быть очищены неидентифицированными или визуализированными in situ иммунофлуоресцентными.
Начать подготовку тканевого лизата можно с добавления буфера лизиса в объеме от 12 до 15 раз больше влажного веса ткани и тритурировать ткань до тех пор, пока она не гомогенизируется. Нагрейте этот гомогенат в течение 15 минут до 75 градусов цельсия, чтобы денатурировать белок, затем центрифугировать образец и перенести супернатант в новую трубку. Этот образец можно хранить при минус 80 градусах Цельсия.
Далее для алкилирования разводят гомогенизированный образец два-три раза в фосфатном солевом буфере, содержащем ингибитор протеазы без ЭДТА. Затем добавляют свежеприготовленный йодоацетамид до конечной концентрации 20 миллимолей. Оставьте образец на один-два часа при температуре 20 градусов Цельсия в темноте.
Повторите этапы добавления и инкубации йодоацетамида дважды. Подготовьте колонну в соответствии с инструкциями производителя, сначала вихрев колонны. Затем снимая крышку, разрезаем нижнюю часть и центрифугируем их.
Затем выполните буферный обмен, сначала уравновешивая столбцы буферного обмена с помощью буфера обмена химией щелчка, а затем обмениваясь всеми алкилированными образцами. Для оценки включения азидонорлейцина берут 40 микролитров упомянутого образца и добавляют фосфатный солевой буфер к конечному объему 120 микролитров. Затем настройте химическую реакцию щелчка, вихрев реакцию в течение 20 секунд.
После добавления каждого реагента в указанном порядке как можно быстрее, инкубируйте образцы в темноте при четырех градусах Цельсия в течение ночи с непрерывным вращением. На следующий день центрифугируйте образцы в течение пяти минут при 17 000 G после центрифугирования будет видна слегка бирюзовая гранула. Перенесите супернатант в новую пробирку и храните образец при минус 80 градусах Цельсия.
Для маркировки белковой очистки. Подвергните все образцы процедуре буферного обмена, как показано для очистки остатков свободного алкина с использованием буфера связывания нейтравидина в качестве буфера равновесия. Затем трижды промыть бусины нейтравидина большой емкости, смешав бусины с буфером связывания.
Центрифугируйте смесь, выбросьте супернатант и повторите это три раза. Затем приготовьте суспензию один к одному, добавив тот же объем нейтравидиновых сухих шариков и буфер связывания нейтравидина. Отложите от 20 до 40 микролитров каждого образца в качестве предварительно очищенного лизата и храните его при минус 20 градусах Цельсия.
После измерения концентрации белка в образце смешайте один миллиграмм белка с 40 микролитрами шариковой суспензии. Инкубируйте смесь в течение ночи при четырех градусах Цельсия с непрерывным вращением, позволяя меченым белкам связываться с шариками. На следующий день собирают супернатант методом центрифугирования.
Отложите от 20 до 40 микролитров аликвоты супернатанта в сторону для последующего анализа и заморозьте остальные при минус 80 градусах Цельсия. Затем трижды вымойте бусины, добавив охлажденный нейтравидин, промывочный буфер один. Осаждение бусин и выброс супернатанта.
Затем добавьте тот же буфер и высиживайте шарики в течение 10 минут при непрерывном вращении при четырех градусах Цельсия, прежде чем выбросить супернатант. Повторите промывку нейтравидином, промывая буферами два и три, и элюируйте щелкающие белки, насиживая бусины в течение 30 минут при 20 градусах Цельсия с объемом буфера элюирования нейтравидина, соответствующего одному объему используемых сухих шариков. Во время элюирования выдерживайте бусины в суспензии со скоростью 1000 оборотов в минуту в термоблок шейкере дважды ускользают и соединяйте оба элюта.
Реакции кликов были проанализированы с помощью SDS page и западного иммуноблота. Репрезентативные изображения экспериментов показаны для введения азидонорлейцина путем внутриперитонеальной инъекции и для введения азидонорлейцина через питьевую воду. Дальнейший эксперимент дает пример для определения оптимальной концентрации расщепляемого алкина дисульфида биотина.
В этом примере изменение складки между меченым образцом и контролем является самым высоким при концентрации 14 микромолярного алкина. Здесь показан пример результата масс-спектрометрии с четким обогащением в образце, меченом азидонорлейцином, по сравнению с контролем. Эта разница уже была видна в общем белковом пятне.
Помимо изменений интенсивности пептидов, в обоих образцах также обнаружены уникальные белки. Это технически сложный протокол, и этот шаг должен тщательно соблюдаться с использованием надлежащих отрицательных элементов управления алкилированием, правильной (неразборчиво) и адекватной очистки архива без щелчка. Наши ключевые шаги в этом протоколе, очищенные белки могут быть либо идентифицированы масс-спектрометрией, если исследователи заинтересованы в изучении белков, либо загрузить их в гель для изучения белков, представляющих интерес с помощью вестерн-блоттинга.
Способность этого метода маркировать белки определенного клеточного происхождения имеет множество применений, таких как натяжение белков или изучение синтеза белка in vitro или in vivo.
