Questo protocollo consente di marcare le proteine in modo specifico per un tipo di cellula. Questa è la prima tecnica che offre tale possibilità e può essere eseguita in vitro o in vivo. Il vantaggio principale della tecnica è che le proteine specifiche del tipo di cellula marcate possono essere purificate non identificate o visualizzate in situ mediante immunofluorescente.
Per iniziare preparare il lisato tissutale aggiungendo tampone di lisi ad un volume da 12 a 15 volte il peso umido del tessuto e triturare il tessuto fino a quando non è omogeneizzato. Riscaldare questo omogenato per 15 minuti a 75 gradi Celsius per denaturare la proteina, quindi centrifugare il campione e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Questo campione può essere memorizzato a meno 80 gradi Celsius.
Successivamente, per l'alchilazione, diluire il campione omogeneizzato due o tre volte in tampone salino fosfato contenente un inibitore della proteasi privo di EDTA. Quindi aggiungere iodoacetamide appena preparato a una concentrazione finale di 20 millimoli. Lasciare il campione per una o due ore a 20 gradi Celsius al buio.
Ripetere l'aggiunta di iodoacetamide e le fasi di incubazione due volte. Preparare la colonna secondo le istruzioni del produttore facendo prima vortice le colonne. Quindi rimuovendo il coperchio tagliando la parte inferiore e centrifugandoli.
Quindi, eseguire uno scambio di buffer bilanciando prima le colonne di scambio del buffer utilizzando il buffer di scambio della chimica dei clic e quindi scambiando tutti i campioni alchilati. Per valutare l'incorporazione di azidonorleucina prendere 40 microlitri del campione alluso e aggiungere tampone salino fosfato ad un volume finale di 120 microlitri. Quindi impostare la reazione chimica del clic facendo vortice la reazione per 20 secondi.
Dopo aver aggiunto ciascun reagente nell'ordine indicato il più velocemente possibile, incubare i campioni al buio a quattro gradi Celsius durante la notte con rotazione continua. Il giorno seguente centrifugare i campioni per cinque minuti a 17.000 volte G dopo la centrifugazione sarà visibile un pellet leggermente turchese. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservare il campione a meno 80 gradi Celsius.
Per la purificazione delle proteine marcate. Sottoporre tutti i campioni ad una procedura di scambio tampone come dimostrato per pulire gli avanzi di alchine libero usando tampone legante la neutravidina come tampone di equilibrio. Quindi lavare le sfere ad alta capacità di neutravidina tre volte mescolando le perle con il tampone legante.
Centrifugare la miscela, scartare il surnatante e ripetere questa operazione tre volte. Quindi preparare un impasto one-to-one aggiungendo lo stesso volume di sfere secche di neutravidina e tampone legante la neutravidina. Mettere da parte da 20 a 40 microlitri di ciascun campione come lisato prepurificato e conservarlo a meno 20 gradi Celsius.
Dopo aver misurato la concentrazione proteica del campione, mescolare un milligrammo di proteine con 40 microlitri di liquame di perline. Incubare la miscela durante la notte a quattro gradi Celsius con rotazione continua che consente alle proteine marcate di legarsi alle perle. Il giorno seguente raccogliere il surnatante mediante centrifugazione.
Mettere da parte un'aliquota da 20 a 40 microlitri del surnatante per un'analisi successiva e congelare il resto a meno 80 gradi Celsius. Quindi, lavare le perle tre volte aggiungendo il tampone di lavaggio per neutravidina raffreddato. Sedimentare le perle e scartare il surnatante.
Quindi aggiungere lo stesso tampone e incubare le perle per 10 minuti sotto rotazione continua a quattro gradi Celsius prima di scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio con tamponi di lavaggio della neutravidina due e tre ed eluire le proteine cliccate incubando le perle per 30 minuti a 20 gradi Celsius con un volume di tampone di eluizione della neutravidina, corrispondente a un volume delle sfere secche utilizzate. Durante l'eluizione, mantenere le perle in sospensione a 1000 giri al minuto in uno shaker termoblocco eludere due volte e unire entrambe le eluizioni.
Le reazioni di clic sono state analizzate dalla pagina SDS e dall'immunoblot occidentale. Immagini rappresentative degli esperimenti sono mostrate per la somministrazione di azidonorleucina mediante iniezione intraperitoneale e per la somministrazione di azidonorleucina tramite acqua potabile. Un ulteriore esperimento fornisce un esempio per la determinazione della concentrazione ottimale di alchine disolfuro biotina.
In questo esempio, la variazione di piega tra il campione marcato e il controllo è più alta a 14 concentrazioni di alchine micromolari. Un esempio di risultato della spettrometria di massa con un chiaro arricchimento nel campione marcato con azidonorleucina rispetto al controllo è mostrato qui. Questa differenza era già visibile nella colorazione proteica totale.
Oltre ai cambiamenti nell'intensità dei peptidi, ci sono anche proteine uniche trovate in entrambi i campioni. Si tratta di un protocollo tecnicamente complesso ed è un passaggio che deve essere seguito attentamente utilizzando opportuni controlli negativi alchilazione, corretta (indistinta) e adeguata pulizia dell'archivio non click. I nostri passaggi chiave in questo protocollo, le proteine purificate possono essere identificate mediante spettrometria di massa se l'interesse dei ricercatori è studiare le proteine o caricarlo in un gel per studiare le proteine di interesse per western blot.
La capacità di questo metodo di marcare le proteine da una specifica origine cellulare ha molte applicazioni come la tensione delle proteine o lo studio della sintesi proteica in vitro o in vivo.
