Este protocolo torna possível rotular proteínas de uma maneira específica do tipo celular. Esta é a primeira técnica que oferece tal possibilidade e pode ser feita in vitro ou in vivo. A principal vantagem da técnica é que as proteínas específicas do tipo celular marcadas podem ser purificadas não identificadas ou visualizadas in situ por imunofluorescência.
Para começar a preparar o lisado de tecido, adicionando tampão de lise a um volume de 12 a 15 vezes o peso úmido do tecido e triturar o tecido até que ele seja homogeneizado. Aqueça este homogeneizado por 15 minutos a 75 graus Celsius para desnaturar a proteína, em seguida, centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius.
Em seguida, para alquilação, diluir a amostra homogeneizada duas a três vezes em tampão salino fosfato contendo um inibidor de protease livre de EDTA. Em seguida, adicione a iodoacetamida recém-preparada a uma concentração final de 20 milimoles. Deixe a amostra por uma a duas horas a 20 graus Celsius no escuro.
Repita as etapas de adição e incubação de iodoacetamida duas vezes. Prepare a coluna de acordo com as instruções do fabricante, primeiro vórtice as colunas. Em seguida, retire a tampa cortando a parte inferior e centrifugando-a.
Em seguida, execute uma troca de buffer primeiro equilibrando as colunas de troca de buffer usando o buffer de troca química de clique e, em seguida, trocando todas as amostras alquiladas. Para avaliar a incorporação de azidonorleucina pegue 40 microlitros da amostra aludida e adicione tampão salino fosfato a um volume final de 120 microlitros. Em seguida, configure a reação química do clique vortexing a reação por 20 segundos.
Depois de adicionar cada reagente na ordem indicada o mais rápido possível, incubar as amostras no escuro a quatro graus Celsius durante a noite com rotação contínua. No dia seguinte, centrifugar as amostras por cinco minutos a 17.000 vezes G após a centrifugação, um pellet ligeiramente turquesa será visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e armazene a amostra a menos 80 graus Celsius.
Para purificação de proteína marcada. Submeter todas as amostras a um procedimento de troca de tampão, conforme demonstrado para limpar as sobras de alquino livre usando o tampão de ligação de neutravidina como tampão de equilíbrio. Em seguida, lave as contas de alta capacidade de neutravitina três vezes, misturando as contas com o tampão de ligação.
Centrifugar a mistura, descartar o sobrenadante e repeti-lo três vezes. Em seguida, prepare uma pasta um-para-um, adicionando o mesmo volume de contas secas de neutravidina e tampão de ligação de neutravidina. Reserve 20 a 40 microlitros de cada amostra como lisado pré-purificado e armazene-o a menos 20 graus Celsius.
Após a medição da concentração de proteína da amostra, misture um miligrama de proteína com 40 microlitros da pasta de miçangas. Incubar a mistura durante a noite a quatro graus Celsius com rotação contínua, permitindo que as proteínas marcadas se liguem às contas. No dia seguinte, recolher o sobrenadante por centrifugação.
Separe uma alíquota de 20 a 40 microlitros do sobrenadante para análise posterior e congele o restante a menos 80 graus Celsius. Em seguida, lave as contas três vezes adicionando um tampão de lavagem de neutravidina refrigerado. Sedimentar as contas e descartar o sobrenadante.
Em seguida, adicione o mesmo tampão e incube as contas por 10 minutos sob rotação contínua a quatro graus Celsius antes de descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem com tampões de lavagem de neutravidina dois e três e eluir as proteínas clicadas incubando as contas por 30 minutos a 20 graus Celsius com um volume de tampão de eluição de neutravidina, correspondente a um volume das contas secas utilizadas. Durante a eluição, mantenha as contas em suspensão a 1000 rotações por minuto em um agitador de bloco térmico iludir duas vezes e combinar ambas as eluidas.
As reações de cliques foram analisadas por SDS page e Western immuno blot. Imagens representativas dos experimentos são mostradas para a administração de azidonorleucina por injeção intraperitoneal e para a administração de azidonorleucina via água potável. Um outro experimento fornece um exemplo para a determinação da concentração ideal de alcina clivável de biotina dissulfureto.
Neste exemplo, a mudança de dobra entre a amostra rotulada e o controle é maior na concentração de alquino micromolar 14. Um exemplo de um resultado de espectrometria de massa com um claro enriquecimento na amostra marcada com azidonorleucina em comparação com o controle é mostrado aqui. Essa diferença já era visível na coloração proteica total.
Além das mudanças na intensidade do peptídeo, há também proteínas únicas encontradas em ambas as amostras. Este é um protocolo tecnicamente complexo e é um passo que deve ser cuidadosamente seguido usando alquilação de controles negativos adequados, limpeza adequada (indistinta) e adequada do arquivo não clicado. Nossos principais passos neste protocolo, as proteínas purificadas podem ser identificadas por espectrometria de massa se o interesse dos pesquisadores é estudar proteínas ou carregá-las em um gel para estudar proteínas de interesse por western blot.
A capacidade deste método de marcar proteínas de uma origem celular específica tem muitas aplicações, como a tensão de proteínas ou o estudo da síntese proteica in vitro ou in vivo.
