Bitki hücresi büyümesi, hücre duvarlarının mekanik özellikleri tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bu özellikleri bitkilerin farklı organ ve dokularında bilmek önemlidir. Burada sunulan yöntem, genç bitkilerin iç dokularında sabit olmayan ve dehidrate olmayan hücre duvarlarının biyomekanik karakterizasyonuna izin verir.
Vibratom kesiti için çözeltileri ve numuneyi hazırlayarak başlayın. Petri kabının dibine dört milimetrelik bir erimiş% 3 agaroz tabakası dökün ve numuneye termal zarar gelmesini önlemek için hafifçe soğumaya bırakın. Bitki organının yaklaşık beş milimetre uzunluğunda üç veya dört parçasını agarozun üzerine yatay olarak yerleştirin.
Yaklaşık 30 ila 60 saniye sonra, ilk agaroz tabakasının üstünde ince bir yarı katı film görünecektir. Ardından, üstüne dikkatlice ikinci bir katman dökün. Agaroz tamamen katılaştıktan sonra, örneği içeren bloğu kesin.
Daha sonraki kesitleme sırasında stabilitesini sağlamak için bloğu altıgen kesilmiş bir piramit halinde şekillendirin. Numune kesitine vibratom ile başlamadan önce, bloğu siyanoakrilat yapıştırıcı ile vibratom aşamasına yapıştırın. Sahneyi vibratoma yerleştirin, böylece piramit köşelerinden biri vibratomun bıçağına bakar ve vibratom banyosuna su dökün.
Kesit kalınlığı, bıçak hızı ve titreşim frekansı gibi kesit parametrelerini ayarlayın ve numuneyi kesin. İnce bir fırça kullanarak, bölümü su banyosundan bir cam kaydırağa taşıyın ve kurumasını önlemek için bölüme bir damla su yerleştirin. Bölümün kalitesini bir ışık mikroskobu altında kontrol ettikten sonra, bölüm düzlemine dik hücre duvarına sahip uygun bölümü seçin.
Daha sonra, bir pipet kullanarak Petri kabı kapağının dibine bir mililitrelik %1 erimiş agaroz tabakası dökerek atomik kuvvet mikroskobu ölçümleri için bölümü hareketsiz hale getirin. Agaroz katılaştıktan sonra, filtre kağıdını kenarına getirerek fazla suyu bölümden çıkarın. Bölümü slayttan Petri kabı kapağının ortasına bir fırça kullanarak dikkatlice aktarın.
Daha sonra, 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak bölümün etrafına% 1 agaroz dikkatlice ekleyin ve atomik kuvvet mikroskobu için suyu veya başka bir çözeltiyi, hareketsiz bölümle Petri kabı kapağına dökün. Optik mikroskopu kullanarak atomik kuvvet mikroskobu konsolunun altındaki numuneyi yönlendirin. Numuneye temas modunda bir nanoamper ayar noktasıyla yaklaşmak için Yaklaşım düğmesine ve ardından İniş düğmesine tıklayın.
Tarama düğmesine ve ardından Alan düğmesine tıklayın. Taranacak alan boyutunu 50 mikrometreye 50 mikrometre olarak seçin. Probu Taşı düğmesine tıklayın ve tarayıcıyı üzerinde hareket ettirerek ve tarayıcı çıkıntısının derecesine göre en yüksek noktayı bularak tüm tarama alanını kontrol edin.
Yaklaşım sekmesini açın. Ardından, örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın. Hedef olarak en yüksek noktayı kullanarak, örneğe tekrar yaklaşmak için Açılış düğmesini tıklayın.
Ardından, Probu Taşı düğmesine tıklayarak ve tarayıcıyı üzerinde hareket ettirerek yüzeyi tekrar kontrol edin. Tarama hızını 0,5 hertz olarak ayarlayın ve tarama boyutunu 50 mikrometreye 50 mikrometreye ve tarama noktasını 64 x 64 olarak ayarlayın. Çalıştır düğmesine tıklayın ve numunenin yüzeyini ve agaroz ile kontaminasyonun mümkün olup olmadığını kontrol etmek için tarayın.
Açık düğmesine tıkladıktan sonra, programın ana penceresindeki açılır menüden HDPlus modunu seçin ve ana program penceresinde ayar noktasını 0,1 nanoamper olarak ayarlayın. HD penceresinin ana sekmesinde, incelenen örneğe uygun tarama parametrelerini ayarlayın. Ardından HD penceresinde Sesler sekmesini açın ve konsol rezonans frekansını girin.
HD penceresinin Miktar sekmesini açın ve IOS, konsol sertliği, uç yarıçapı ve açısını girin. Uç geometrisine bağlı olarak hesaplamalar için kullanılacak temas modelini seçin. Bundan sonra, HD penceresinin Tara sekmesini açın ve sinyalleri ve sinyalin kaydedildiği yönü seçin.
Tüm kuvvet eğrilerinin kaydını almak için Sesi Zorla kutusunu işaretleyin ve geri bildirim döngüsünü açmak için ana program penceresinin üstündeki Kapalı düğmesine tıklayın Optik sistemin hassasiyetini düzeltmek için ana HD penceresindeki Faz Çekirdeği düğmesine tıklayın. Ana HD penceresinin Zamana Karşı sekmesi, DFL sinyalinin zamana karşı işlevini gerçek zamanlı olarak sunar. Bu işlevin temel düzey belirleme için kullanılacak ve daha sonraki hesaplamalar için temas modeline uyacak parçalarını seçin.
Şimdi, programın ana penceresinde tarama noktası değerini 256 x 256 olarak ayarlayın. Ardından, tarama hızını 0,2 hertz olarak ayarlayın ve örneği taramak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Tarama durduktan sonra, geri bildirim döngüsünü kapatmak için ana pencerenin üstündeki Açık düğmesine tıklayın.
Açılır menüden Kişi Modu'nu seçin, Yaklaşım sekmesini açın ve örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın. Analiz yazılımını açmak ve çıktıyı kaydetmek için Veri düğmesine tıklayın. Kaydedilen dosyayı analiz yazılımında açın.
HD kuvvet ses çerçevesini seçin. Kontrol tuşunu basılı tutun ve aynı tarama yönünde elde edilen bir görsel kare seçin. Hücre duvarlarının nerede olduğunu görmek için Dış Haritayı Yükle düğmesine tıklayın.
Ana sekmedeki InvOptSens ve konsol sertliği değerlerini kontrol edin. Ek sekmesini açın ve uç parametrelerini ve temas modelini kontrol edin. Görsel çerçevedeki hücre duvarlarındaki çeşitli noktalara tıklayın ve yalnızca model tarafından iyi tanımlanmış eğrileri seçin.
Modül haritasındaki beyaz alanlar, tarayıcının Z yönünde sınırına ulaşması nedeniyle Young modülünün hatalı bir şekilde abartılmasına karşılık gelir. Bu görüntü, tatmin edici kuvvet eğrilerinin daha fazla seçimi için harici bir harita olarak kullanılmak üzere uygun değildir. Bununla birlikte, sağda sunulan DFL sinyal haritası burada daha uygundur.
Farklı cihazlar DFL sinyallerini sapma veya hata sinyalleri olarak adlandırabilir. Numunenin dibine ulaşmaya çalışırken tamamen genişletilmiş olan tarayıcı, hatalı ölçümlere ve hatta taramaların kesintiye uğramasına neden olabilir. Agaroz varlığı, temas modunda ilk tarama elde edilirken kontrol edilebilir, çünkü hücre duvarları ve bazı hücre dipleri bu tür taramalarda görülebilir.
Bununla birlikte, yanlış hareketsizlik durumunda, yüzey, örnek topografyasını maskeleyen agaroz ile kaplanabilir. Aynı hücre duvarının farklı noktalarında kaydedilen dört farklı kuvvet eğrisinden, 0.1'de kaydedilen eğri taban çizgisi göstermez, yani konsol ucunun hücre duvarından ayrılması anlamına gelmez. 0.3'te kaydedilen eğri, yaklaşan kısımda hücre duvarının büküldüğünü gösteren bir omuz gösterir.
İkinci ve dördüncü noktalar, benzer modül değerlerine sahip tatmin edici kuvvet eğrileri gösterir. Numune hazırlama ve inceleme pratik gerektirir, ancak ustalaşılabilir. Bu protokolün önemli bir parçası, ortaya çıkan eğrileri filtrelemektir.
Otomatik olarak hesaplanan modüllere güvenmeyin. Aynı teknik, yapışma kuvvetlerini veya enerji dağılımını ölçmek için de kullanılabilir. Bazı malzemelerin viskon veya viskoelastik davranışının tanımlanması için de önemli olabilir.
