La croissance des cellules végétales est contrôlée par les propriétés mécaniques de leurs parois cellulaires. Par conséquent, il est important de connaître ces propriétés dans différents organes et tissus des plantes. La méthode présentée ici permet la caractérisation biomécanique des parois cellulaires non fixes et non déshydratées dans les tissus internes des jeunes plantes.
Commencez par préparer les solutions et l’échantillon pour la section du vibratome. Versez une couche de quatre millimètres de 3% d’agarose fondu sur le fond de la boîte de Petri et laissez-la refroidir légèrement pour éviter d’endommager l’échantillon par la chaleur. Placez environ cinq millimètres de long trois ou quatre morceaux de l’organe de la plante horizontalement sur l’agarose.
Environ 30 à 60 secondes plus tard, un mince film semi-solide apparaîtra au-dessus de la première couche d’agarose. Ensuite, versez soigneusement une deuxième couche sur le dessus. Une fois l’agarose complètement solidifiée, découpez le bloc contenant le spécimen.
Façonnez le bloc en une pyramide tronquée hexagonale pour assurer sa stabilité lors de la section ultérieure. Avant de commencer la section de l’échantillon avec le vibratome, collez le bloc à l’étage du vibratome avec un adhésif cyanoacrylate. Placez la scène dans le vibratome, de sorte que l’un des coins de la pyramide fasse face à la lame du vibratome et versez de l’eau dans le bain de vibratome.
Définissez les paramètres de sectionnement tels que l’épaisseur de la section, la vitesse de la lame et la fréquence de vibration et coupez l’échantillon. À l’aide d’une brosse fine, déplacez la section du bain-marie sur une lame de verre et placez une goutte d’eau sur la section pour l’empêcher de se dessécher. Après avoir vérifié la qualité de la section au microscope optique, sélectionnez la section appropriée ayant une paroi cellulaire perpendiculaire au plan de la section.
Ensuite, immobiliser la section pour les mesures de microscopie à force atomique en versant une couche d’un millilitre d’agarose fondue à 1% sur le fond du capuchon de la boîte de Petri à l’aide d’une pipette. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, enlever l’excès d’eau de la section en amenant le papier filtre sur son bord. Transférez délicatement la section de la lame au centre du capuchon vaisselle de Petri à l’aide d’un pinceau.
Ensuite, ajoutez soigneusement 1% d’agarose autour de la section à l’aide d’une pipette de 20 microlitres et versez l’eau ou une autre solution pour la microscopie à force atomique dans le capuchon de la boîte de Petri avec la section immobilisée. Guidez l’échantillon sous le porte-à-faux de microscopie à force atomique à l’aide du microscope optique. Cliquez sur le bouton Approche, puis sur le bouton Atterrissage pour approcher l’échantillon en mode contact avec un point de consigne d’un nanoampère.
Cliquez sur le bouton Numérisation, puis sur le bouton Zone. Sélectionnez la taille de zone de 50 micromètres par 50 micromètres à numériser. Cliquez sur le bouton Déplacer la sonde et vérifiez toute la zone de numérisation en déplaçant le scanner dessus et en trouvant le point le plus élevé en fonction du degré de saillie du scanner.
Ouvrez l’onglet Approche. Cliquez ensuite sur le bouton Supprimer pour vous rétracter de l’échantillon. En utilisant le point le plus élevé comme cible, cliquez sur le bouton Atterrissage pour vous approcher à nouveau de l’échantillon.
Vérifiez ensuite à nouveau la surface en cliquant sur le bouton Déplacer la sonde et en déplaçant le scanner dessus. Réglez la fréquence de balayage sur 0,5 hertz, définissez la taille de numérisation sur 50 micromètres sur 50 micromètres et le point de balayage sur 64 sur 64. Cliquez sur le bouton Exécuter et scannez pour vérifier la surface de l’échantillon et sa contamination possible par l’agarose.
Après avoir cliqué sur le bouton On, choisissez le mode HDPlus dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme et définissez le point de consigne sur 0,1 nanoampère dans la fenêtre principale du programme. Dans l’onglet principal de la fenêtre HD, définissez les paramètres de numérisation appropriés à l’échantillon étudié. Ouvrez ensuite l’onglet Bruits dans la fenêtre HD et entrez la fréquence de résonance du porte-à-faux.
Ouvrez l’onglet Quant de la fenêtre HD et entrez l’IOS, la rigidité en porte-à-faux, le rayon de pointe et l’angle. Sélectionnez le modèle de contact, qui sera utilisé pour les calculs en fonction de la géométrie de la pointe. Après cela, ouvrez l’onglet Scan de la fenêtre HD et sélectionnez les signaux, ainsi que la direction dans laquelle le signal est enregistré.
Cochez la case Force Volume pour obtenir un enregistrement de toutes les courbes de force et cliquez sur le bouton Off en haut de la fenêtre principale du programme pour activer la boucle de rétroaction Cliquez sur le bouton Phase Core dans la fenêtre HD principale pour corriger la sensibilité du système optique. L’onglet Versus Time de la fenêtre HD principale présente la fonction du signal DFL en fonction du temps en temps réel. Sélectionnez les parties de cette fonction qui seront utilisées pour la détermination du niveau de référence et pour ajuster le modèle de contact pour d’autres calculs.
Maintenant, définissez la valeur du point d’analyse sur 256 par 256 dans la fenêtre principale du programme. Ensuite, réglez la vitesse de balayage sur 0,2 hertz et cliquez sur le bouton Exécuter pour analyser l’échantillon. Une fois la numérisation terminée, cliquez sur le bouton On en haut de la fenêtre principale pour désactiver la boucle de rétroaction.
Choisissez Mode Contact dans le menu déroulant, ouvrez l’onglet Approche et cliquez sur le bouton Supprimer pour vous retirer de l’échantillon. Cliquez sur le bouton Données pour ouvrir le logiciel d’analyse et enregistrer la sortie. Ouvrez le fichier enregistré dans le logiciel d’analyse.
Sélectionnez l’image HD force volume. Maintenez la touche Ctrl enfoncée et sélectionnez une image visuelle obtenue dans la même direction de numérisation. Cliquez sur le bouton Charger la carte externe pour voir où se trouvent les parois cellulaires.
Vérifiez les valeurs de rigidité InvOptSens et cantilever dans l’onglet principal. Ouvrez l’onglet Supplémentaire et vérifiez les paramètres de l’astuce et le modèle de contact. Cliquez sur différents points des parois cellulaires du cadre visuel et sélectionnez uniquement les courbes bien décrites par le modèle.
Les zones blanches dans la carte de module correspondent à une surestimation erronée du module de Young due au scanner atteignant sa limite dans la direction Z. Cette image ne peut pas être utilisée comme carte externe pour une sélection ultérieure de courbes de force satisfaisantes. Cependant, la carte des signaux LDF présentée à droite convient mieux ici.
Différents instruments peuvent se référer aux signaux DFL en tant que signaux de déviation ou d’erreur. Le scanner qui a été complètement étendu en essayant d’atteindre le fond de l’échantillon peut entraîner des mesures erronées et même des balayages interrompus. La présence d’agarose peut être vérifiée lors de l’obtention du premier balayage en mode contact car les parois cellulaires et certains fonds cellulaires sont visibles sur ces scans.
Cependant, en cas d’immobilisation imprécise, la surface peut être recouverte d’agarose, ce qui masque la topographie de l’échantillon. Sur quatre courbes de force différentes enregistrées en différents points de la même paroi cellulaire, la courbe enregistrée à 0,1 ne montre aucune ligne de base, ce qui signifie aucune séparation de la pointe en porte-à-faux de la paroi cellulaire. La courbe enregistrée à 0,3 montre un épaulement sur la partie approchante indiquant une flexion de la paroi cellulaire.
Les points deux et quatre montrent des courbes de force satisfaisantes avec des valeurs de modules similaires. La préparation et l’examen des échantillons nécessitent de la pratique, mais ils peuvent être maîtrisés. Une partie cruciale de ce protocole consiste à filtrer les courbes résultantes.
Ne vous fiez pas aux modules, qui ont été calculés automatiquement. La même technique peut être utilisée pour mesurer les forces d’adhésion ou la dissipation d’énergie. Il peut également être important pour la description du comportement viscose ou viscoélastique de certains matériaux.
