Электропорация-опосредованный перенос генов в мышцах является простым и эффективным методом исследования изменений в физиологии мышц. Мы обнаружили, что электропорация не ставит под угрозу сократимость мышц. Электропорация генных конструкций в мышцы in vivo – простая и эффективная процедура, не требующая более обширной упаковки генных конструкций в вирусные векторы.
Трудно визуализировать, изолировать и вводить ЭДЛ из-за его расположения и небольшого размера. Практика на туше мыши и инъекция биологических чернил, таких как индийские чернила, могут помочь в предоставлении доказательств достаточной инъекции. Продемонстрировать процедуру будет Брайан Хейн, постдок из моей лаборатории.
Перед инъекцией мыши подтвердите хирургическую плоскость анестезии с помощью щипцов с отсутствием рефлекса защемления пальца ноги, затем переместите мышь в носовой конус, покоящийся на циркулирующей водяной пластине при 37 градусах Цельсия для остальной части процедуры. После того, как мышь помещена в положение лежа на спине, удалите волосы с обеих задних конечностей с помощью небольших машинок для резания волос, затем продезинфицируйте область инъекции с чередованием 70% этанола и бетадина. Для инъекции найдите переднюю часть большеберцовой кости или сухожилие TA, видимое через кожу на боковой стороне голени, и отметьте верхний конец мышцы TA.
Затем вставьте иглу 30-го калибра, установленную на 50-микролитровом микрошприце, в мышцу под неглубоким углом в пять градусов на один-два миллиметра выше миотендинозного соединения, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы. Нажмите на поршень, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы доставить 50 микролитров плазмидного раствора в мышцу. Мышца должна набухать.
Установите таймер на одну минуту и измерьте толщину ноги в мышце ТА, затем установите электроды суппорта на измеренную толщину. Затем установите напряжение электропоратора на 12,5 вольт на миллиметр. Через одну минуту поместите электроды суппорта близко вокруг нижней конечности, не будучи чрезмерно плотными, чтобы подать пять импульсов квадратной волны с длительностью 20 миллисекунд и интервалами 200 миллисекунд.
Мышца должна дергаться с каждым импульсом. Повторите процедуру с другой конечностью, используя контрольный плазмидный вектор. Когда это будет сделано, извлеките мышь из носового конуса и дайте мыши восстановиться на грелке, установленной на 37 градусов по Цельсию.
После выздоровления верните мышь в клетку. Когда мышь находится в положении лежа, найдите передний гребень большеберцовой кости визуально и через мягкое сердцебиение. Используйте скальпель, чтобы сделать неглубокий разрез через кожу на боковой стороне переднего гребня большеберцовой кости на пять миллиметров ниже колена на два миллиметра выше миотендинозного соединения ТА.
С помощью мелких ножниц тупо рассекают фасцию, обнажая мышцу ТА, а затем аккуратно отделяют мышцу ТА от большеберцовой кости, потянув мышцу, чтобы выявить разгибатель digitorum longus или EDL. Держите ТА чистым от EDL во время процедуры, используя небольшие изогнутые щипцы. Вставьте иглу 30-го калибра в EDL продольно, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы, и введите 10 микролитров плазмидного раствора, как показано ранее.
Мышца EDL должна набухать. Измерьте толщину ножки в EDL и установите электроды суппорта на измеренную толщину, чтобы доставить пять импульсов квадратной волны, как объяснялось ранее. Когда это будет сделано, закройте разрез одноразовыми 4-0 нерассасывающимися нейлоновыми швами.
Позже извлеките мышь из носового конуса и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 градусов цельсия. Введите соответствующий подкожный анальгетик сразу после операции и через 12-24 часа после операции. После выздоровления верните мышь в домашнюю клетку.
После инъекции и электропорации плазмиды pcDNA3-EGFP в мышцах ТА и ЭДЛ наблюдалась экспрессия GFP, указывающая на поглощение ДНК в мышечных волокнах. При изображении при меньшем увеличении эффективность трансфекции мышц EDL может быть визуализирована через появление зеленых волокон по сравнению с черными волокнами. Введенные и электропорированные EDL имели аналогичные тетанические реакции при 100 Гц по сравнению с контрольными неинъекционными или электропорированными мышцами.
Введенный и электропорированный EDL, тетаническая мышечная сила, удельная тетаническая мышечная сила, время до пикового напряжения и половинное время релаксации не были скомпрометированы по сравнению с нетронутым контролем. Важно точно определить мышцу, подлежащую инъекции, и эффективно доставить плазмидный раствор. С помощью этого протокола может быть проведен ряд гистологических и биохимических измерений.
Может быть проведена клеточная локализация целевого белка, нокдаун гена-мишени, транскрипционные репортеры и массив окрашивания тканей. Этот метод был использован для выявления широкого спектра изменений в молекулярной сигнализации в мышцах во время физиологических и патофизиологических условий. Исследование сократимости мышц после переноса генов возможно с использованием этой техники.
