근육에서의 전기천공-매개 유전자 전달은 근육 생리학의 변화를 조사하는 쉽고 효율적인 기술이다. 우리는 전기 천공이 근육 수축성을 손상시키지 않는다는 것을 발견했습니다. 생체 내에서 근육으로 유전자 구축물을 전기천공하는 것은 유전자 구축물을 바이러스 벡터로 더 광범위하게 패키징할 필요가 없는 간단하고 효율적인 절차이다.
EDL의 위치와 크기가 작기 때문에 EDL을 시각화, 격리 및 주입하는 것은 어렵습니다. 마우스 시체에서 연습하고 인도 잉크와 같은 생물학적 잉크를 주입하면 충분한 주사의 증거를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 포스트 문서 인 Brian Hain이 될 것입니다.
마우스를 주입하기 전에 발가락 핀치 반사가없는 포셉을 사용하여 마취의 수술 평면을 확인한 다음 마우스를 섭씨 37도의 순환 물 플레이트에 놓여있는 코 콘으로 옮기고 나머지 절차 동안. 마우스를 수핀 위치에 놓으면 작은 머리 깎기를 사용하여 뒷다리에서 머리카락을 제거한 다음 70 % 에탄올과 베타 딘을 번갈아 가며 주사 부위를 소독하십시오. 주사의 경우 아래 다리의 측면 측면에서 피부를 통해 보이는 경골 전방 또는 TA 힘줄을 찾아 TA 근육의 우수한 끝을 표시하십시오.
그런 다음 바늘이 근육의 우수한 끝에 도달 할 때까지 50 마이크로 리터 마이크로 주사기에 장착 된 30 게이지 바늘을 근긴장 접합부보다 한 두 밀리미터 떨어진 얕은 5도 각도로 근육에 삽입하십시오. 주입 경로를 따라 바늘을 천천히 후퇴시키면서 플런저를 눌러 50 마이크로리터의 플라스미드 용액을 근육으로 전달한다. 근육이 부풀어 오른다.
타이머를 일분 동안 설정하고 TA 근육에서 다리의 두께를 측정 한 다음 캘리퍼 전극을 측정 된 두께로 설정하십시오. 그런 다음 전기 기공 전압을 밀리미터 당 12.5V로 설정하십시오. 1분 후, 캘리퍼 전극을 하지에 너무 꽉 조이지 않고 하지에 가깝게 배치하여 20밀리초 지속 시간과 200밀리초 간격으로 다섯 개의 구형파 펄스를 전달합니다.
근육은 각 맥박으로 경련을 일으켜야합니다. 대조군 플라스미드 벡터를 사용하여 다른 사지와 함께 절차를 반복한다. 완료되면 코 콘에서 마우스를 제거하고 섭씨 37도까지 설정된 가열 패드에서 마우스를 회복시킵니다.
복구되면 마우스를 케이지로 되돌립니다. 마우스를 수핀 위치에 두고, 경골 앞쪽 볏을 시각적으로 그리고 부드러운 두근 두근 거림을 통해 찾습니다. 메스를 사용하여 경골 전방 볏의 측면 측면에있는 피부를 통해 얕은 절개를 만들어 무릎보다 다섯 밀리미터 열등하고 TA 근관 접합부보다 두 밀리미터 우수합니다.
작은 가위의 도움으로 근막을 뻔뻔스럽게 해부하고 TA 근육을 노출 한 다음 근육을 당겨 경골에서 TA 근육을 부드럽게 분리하여 신전 디지토럼 롱 또는 EDL을 드러냅니다. 작은 곡선 포셉을 사용하여 절차 중에 EDL에서 TA를 깨끗하게 유지하십시오. 바늘이 근육의 우량한 끝에 도달 할 때까지 30 게이지 바늘을 EDL에 세로 방향으로 삽입하고 이전에 입증 된 바와 같이 플라스미드 용액 10 마이크로 리터를 주입하십시오.
EDL 근육이 부풀어 오른다. EDL에서 다리의 두께를 측정하고 캘리퍼 전극을 측정 된 두께로 설정하여 앞에서 설명한 것처럼 다섯 개의 구형파 펄스를 전달하십시오. 완료되면 일회용 4-0 비 흡수성 나일론 봉합사를 사용하여 절개를 닫으십시오.
나중에 코 콘에서 마우스를 제거하고 섭씨 37도까지 설정된 가열 패드에서 회복되도록하십시오. 수술 직후와 수술 후 12 ~ 24 시간 후에 적절한 피하 진통제를 투여하십시오. 일단 회복되면 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓으십시오.
TA 및 EDL 근육에 pcDNA3-EGFP 플라스미드를 주입하고 전기천공한 후, 근섬유에서 DNA 흡수를 나타내는 GFP 발현을 관찰하였다. 더 낮은 배율로 이미징 될 때, EDL 근육 형질 감염 효율은 녹색 섬유 대 검은 색 섬유의 외관을 통해 시각화 될 수 있습니다. 주입된 EDL과 전기천공된 EDL은 대조군 비주입 또는 전기천공된 근육과 비교하여 100 헤르츠에서 유사한 파타닉 반응을 보였다.
주입되고 전기천공된 EDL, 파상근력, 특정 파상근력, 피크 장력까지의 시간, 및 반이완 시간은 손길이 닿지 않은 대조군에 비해 손상되지 않았다. 주사할 근육을 정확하게 식별하고 플라스미드 용액을 효율적으로 전달하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하여 많은 조직학적 및 생화학적 측정이 이루어질 수 있다.
표적 단백질 세포 국소화, 표적 유전자 녹다운, 전사 리포터, 및 조직 염색의 어레이가 실시될 수 있다. 이 기술은 생리학적 및 병리생리학적 조건 동안 근육에서 분자 신호전달의 변화의 광대한 어레이를 확인하기 위해 사용되어 왔다. 유전자 전달 후 근육 수축성에 대한 조사는이 기술을 사용하여 실현 가능합니다.
