Der elektroporationsvermittelte Gentransfer im Muskel ist eine einfache und effiziente Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Elektroporation die Muskelkontraktilität nicht beeinträchtigt. Die Elektroporation von Genkonstrukten in Muskeln in vivo ist ein einfaches und effizientes Verfahren, das keine umfangreichere Verpackung von Genkonstrukten in virale Vektoren erfordert.
Es ist schwierig, die EDL aufgrund ihrer Lage und geringen Größe zu visualisieren, zu isolieren und zu injizieren. Das Üben auf einem Mauskadaver und das Einspritzen von biologischer Tinte wie Indentinte kann dazu beitragen, den Nachweis einer ausreichenden Injektion zu erbringen. Das Verfahren wird von Brian Hain, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert.
Bevor Sie die Maus injizieren, bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie mit einer Pinzette ohne den Zehenquetschreflex und übertragen Sie die Maus dann für den Rest des Eingriffs auf einen Nasenkegel, der auf einer zirkulierenden Wasserplatte bei 37 Grad Celsius ruht. Sobald die Maus in Rückenlage ist, entfernen Sie die Haare von beiden Hinterbeinen mit kleinen Haarschneidemaschinen und desinfizieren Sie dann den Injektionsbereich mit abwechselnd 70% Ethanol und Betadin. Für die Injektion lokalisieren Sie die Tibialis-Anterior- oder TA-Sehne, die durch die Haut auf der lateralen Seite des Unterschenkels sichtbar ist, und markieren Sie das obere Ende des TA-Muskels.
Führen Sie dann eine 30-Gauge-Nadel ein, die auf einer 50-Mikroliter-Mikrospritze montiert ist, in einem flachen Fünf-Grad-Winkel von ein bis zwei Millimetern über der myotendinösen Verbindung in den Muskel, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht. Drücken Sie den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 50 Mikroliter der Plasmidlösung in den Muskel zu bringen. Der Muskel sollte anschwellen.
Stellen Sie den Timer auf eine Minute ein und messen Sie die Dicke des Beines am TA-Muskel, dann stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein. Stellen Sie dann die Elektroporatorspannung auf 12,5 Volt pro Millimeter ein. Platzieren Sie die Bremssattelelektroden nach einer Minute eng um die untere Extremität, ohne zu eng zu sein, um fünf Rechteckwellenimpulse mit einer Dauer von 20 Millisekunden und Intervallen von 200 Millisekunden zu liefern.
Der Muskel sollte mit jedem Puls zucken. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Extremität unter Verwendung des Kontrollplasmidvektors. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Maus vom Nasenkegel und lassen Sie die Maus auf einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizkissen genesen.
Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück. Mit der Maus in Rückenlage lokalisieren Sie den vorderen Kamm des Tibiaknochens visuell und durch sanftes Herzklopfen. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen flachen Schnitt durch die Haut auf der lateralen Seite des Tibia-Vorderkamms zu machen, der fünf Millimeter niedriger als das Knie ist und zwei Millimeter über der TA-myotendinösen Verbindung liegt.
Sezieren Sie mit Hilfe einer kleinen Schere stumpf die Faszie, legen Sie den TA-Muskel frei, und trennen Sie dann den TA-Muskel sanft von der Tibia, indem Sie den Muskel ziehen, um den Extensor digitorum longus oder EDL freizulegen. Halten Sie die TA während des Eingriffs mit einer kleinen gekrümmten Pinzette von der EDL fern. Führen Sie die 30-Gauge-Nadel in Längsrichtung in die EDL ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht, und injizieren Sie 10 Mikroliter der Plasmidlösung, wie zuvor gezeigt.
Der EDL-Muskel sollte anschwellen. Messen Sie die Dicke des Beines am EDL und stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein, um fünf Rechteckwellenimpulse zu liefern, wie zuvor erläutert. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie den Einschnitt mit Einweg-4-0 nicht resorbierbaren Nylonnähten.
Entfernen Sie später die Maus vom Nasenkegel und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizkissen erholen. Verabreichen Sie ein geeignetes subkutanes Analgetikum unmittelbar nach der Operation und 12 bis 24 Stunden nach der Operation. Nach der Wiederherstellung kehrt die Maus in den Heimkäfig zurück.
Nach der Injektion und Elektroporation des pcDNA3-EGFP-Plasmids in die TA- und EDL-Muskeln wurde die GFP-Expression beobachtet, die auf eine DNA-Aufnahme in den Muskelfasern hinweist. Bei einer geringeren Vergrößerung konnte die EDL-Muskeltransfektionseffizienz durch das Auftreten von grünen Fasern im Vergleich zu schwarzen Fasern visualisiert werden. Die injizierten und elektroporated EDLs hatten ähnliche tetanische Reaktionen bei 100 Hertz im Vergleich zu den nicht injizierten oder elektroporated Kontrollmuskeln.
Die injizierte und elektropolierte EDL, die tetanische Muskelkraft, die spezifische tetanische Muskelkraft, die Zeit bis zur Spitzenspannung und die halbe Entspannungszeit wurden im Vergleich zur unberührten Kontrolle nicht beeinträchtigt. Es ist wichtig, den zu injizierenden Muskel genau zu identifizieren und die Plasmidlösung effizient zu liefern. Eine Reihe von histologischen und biochemischen Messungen können mit diesem Protokoll durchgeführt werden.
Die zelluläre Lokalisierung von Zielproteinen, der Knockdown von Zielgenen, transkriptionelle Reporter und eine Reihe von Gewebefärbungen können durchgeführt werden. Diese Technik wurde verwendet, um eine Vielzahl von Veränderungen der molekularen Signalgebung im Muskel unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu identifizieren. Die Untersuchung der Muskelkontraktilität nach Gentransfer ist mit dieser Technik möglich.
