Используя представленные микрофлюидные устройства, мы можем исследовать динамические взаимодействия между грибами и другими микробами с точным пространственным и экологическим контролем, а также визуализацией высокого разрешения на уровне одной клетки. Важно отметить, что грибковый рост может быть ограничен и направлен в микрофлюидный канал. Позволяет получать высококачественные покадровые изображения.
Поэтому можно исследовать сложности грибково-грибковых и грибко-бактериальных взаимодействий. Понимание взаимодействия грибковых микробов является важным шагом в определении и сохранении почвенного микробиома. Эти знания могут быть использованы для разработки новых агентов биоконтроля с устойчивым сельским хозяйством.
Для начала приготовьте примерно 40 граммов поли(диметилсилоксана) или ПДМ, тщательно перемешав основание и отверждающий агент в соотношении 10 к 1 с помощью шпателя в чистом пластиковом стаканчике. Чтобы удалить все пузырьки воздуха, поместите чашку в вакуумную камеру на один час. Затем, используя прозрачную ленту, закрепите основную форму в пластиковом креплении и используйте сжатый фильтрованный воздух для удаления любых частиц пыли, затем вылейте PDM на центр главной формы и дайте ей осесть.
Чтобы предотвратить оседание частиц пыли на поверхности PDM, неплотно накройте основную форму пластиковой крышкой, затем перенесите основную форму в духовку и отверждайте на ночь при 70 градусах Цельсия. После удаления основной формы из духовки и дать ей остыть, отклейте отвержденные ПДН от основной формы и пластиковой рамы, не повредив основную форму в ПДН. Затем, чтобы сохранить поверхность без пыли, поместите прозрачную ленту на микроканалы, выбитые в PDMM.
Затем используйте установленную гильотину или лезвие бритвы, чтобы разрезать PDM на плиты, как указано в конструкции. При разрезании бокового отверстия плиты PDM, используемой для устройства бактериально-грибкового взаимодействия или устройства BFI, убедитесь, что микроканалы полностью открыты. Однако для плит PDM, используемых при сборке устройства грибково-грибкового взаимодействия, или FFI, каждый угол должен быть обрезан так, чтобы он помещался в стеклянную чашку Петри.
Затем используйте прецизионный резак для пробивки входных или выходных отверстий в соответствии с конструкцией устройства. Затем погрузите плиты PDM в 0,5-молярный раствор гидроксида натрия. Промыть плиты в стерильной двойной дистиллированной воде перед переносом их в 70% раствор этанола.
После удаления этанола и промывки плит двойной дистиллированной стерильной водой снова, погрузите плиты в стерильную двойную дистиллированную воду и ультразвук на пять минут, затем извлеките плиту PDM из воды, высушите их сжатым фильтрованным воздухом и поместите их в стерильную квадратную чашку Петри. Затем высиживают чашку Петри с плитой PDM в духовке при 70 градусах Цельсия в течение одного часа. После того, как плиты остынут в свободной от пыли среде, очистите их поверхность от пыли с помощью ленты и сжатого фильтрованного воздуха.
Чтобы активировать поверхности плит ПДН и стеклянных донных чашек Петри, которые впоследствии будут склеены вместе, поместите их в плазменный очиститель с поверхностями, которые будут активированы, обращенными вверх. После удаления плиты ПДН в чашках Петри из плазмоочистителя аккуратно свяжите их, поместив активированные поверхности в конформный контакт друг с другом. Связуйте плиты BFI и FFI PDM с чашками Петри диаметром 35 миллиметров и 55 миллиметров соответственно для проверки успешного склеивания, попробуйте вытащить лабораторию PDM из своей чашки Петри пинцетом.
Тщательно визуализируйте устройство глазом или с помощью общей микроскопии, чтобы обеспечить отсутствие коллапса входных отверстий или микроканалов прививки. Для насыщенных водой или богатых питательными веществами условий пипетка 100 микролитров нужного раствора заполняет BFI приборами сразу после склеивания. Для устройств FFI добавьте 30 микролитров носителя в каждое входное отверстие.
Наконец, добавьте от 100 до 200 микролитров стерильной двойной дистиллированной воды в чашку Петри для поддержания влажности. Однако для ненасыщенных условий воды просто добавьте от 100 до 200 микролитров стерильной двойной дистиллированной воды в чашку Петри для поддержания влажности. Для прививки грибков внутри ламинарной вытяжки, используя стерилизованный пробковый бур, удалите агаровую пробку из колонии на периферии трехдневной культуры, гарантируя, что растущий гифальный фронт остается нетронутым.
Затем вводят агаровую вилку в грибковое отверстие устройства BFI и/или FFI мицелием стороной вниз в гифальной передней части, ориентированной на микроканальные отверстия, чтобы стимулировать гифальную инфильтрацию каналов. Для устройства FFI введите еще одну агаровую пробку со вторым грибковым видом в противоположное входное отверстие. Затем запечатайте чашку Петри прозрачной пленкой и высиживают при температуре от 25 до 28 градусов Цельсия в темноте до получения изображения.
Для бактериальной инокуляции, после извлечения устройства BFI из инкубатора, пипетка 10 микролитров бактериальной суспензии в бактериальное входное отверстие в стерильной среде. После того, как чашка Петри запечатана прозрачной пленкой, храните устройство в вертикальном положении при температуре 25 градусов цельсия в темноте до начала визуализации. Используя этот протокол, взаимодействие между грибком Coprinopsis cinerea и бактерией Bacillus subtilis может быть успешно визуализировано.
Было замечено, что в присутствии бактерии скорость роста грибка начала резко снижаться примерно через пять часов коинокуляции. Более того, грибковые гифы, связанные с бактериями, имели тонкий и прозрачный вид. Флуоресцентная микроскопия также выявила коллапс грибковых гиф после пяти часов коинокуляции bacillus subtilis.
Однако с шести часов бактериальная популяция также начала сокращаться. Визуализация грибково-грибковых взаимодействий показала, что Fusarium graminearum сильно ингибирует рост Trichoderma rossicum, что было очевидно при флуоресцентной микроскопии. Этот протокол дополнительно выявил значительные морфологические изменения в грибе Verticillium longisporum в присутствии бактерий Pseudomonas synxantha и Pseudomonas fluorescens.
Метод динамической визуализации высокого разрешения, используемый в исследовании, также выявил образование перегородок в Fusarium graminearum в присутствии гриба Clonostachys rosea. Флуоресцентная маркировка позволила получить динамическую количественную оценку пролиферации гифрала Clonostachys rosea в устройстве FFI. Эти устройства могут быть адаптированы и модифицированы пользователем для включения различных видов, представляющих интерес, и решения их конкретных экспериментальных вопросов, касающихся грибковых микробных взаимодействий.
Устройства BFI и FFI раздвинули научные границы, показав, как грибы распространяют защитные сигналы и питательные вещества при нападении грибов, вирусов, нематод и позволяя проводить исследования по рассеиванию бактерий.
