Эта модель позволит исследователям на критических доклинических этапах более точно определить антимикробную эффективность новых составов и даст исследователям больший контроль над дизайном и формулированием лекарств. Эта модель обеспечивает быстрые воспроизводимые результаты в репрезентативной среде раны. Это снижает потребность в специально выведенных животных и способствует более быстрому переводу местных противомикробных препаратов при раневых инфекциях в клинику.
Основными проблемами являются загрязнение и ловкость. Строгая асептическая техника и терпение при обработке тканей необходимы; точное и целенаправленное удаление лоскута необходимо для успеха этого метода. Начните с дезинфекции щипцов, подвергая их сухой тепловой стерилизации при 200 градусах Цельсия в течение одного часа.
Автоклавируйте всю стеклянную посуду при 121 градусе Цельсия за 15 минут перед использованием. Продезинфицируйте лоб лампы, вылив на область образца приблизительно 100 миллилитров раствора диоксида хлора 200 PPM. Сбрить участок лба с помощью электрических клиперов с последующей промывкой 200 миллилитрами раствора диоксида хлора 200 PPM.
Протрите область этанолом и синим рулоном и покройте область образца кремом для удаления волос. Через 35 минут аккуратно соскоблите крем для удаления волос с помощью инструмента для соскоба и оцените область образца. Повторите процесс удаления волос, если осталось значительное количество волос.
Промыть чистую область образца 200 миллилитрами раствора диоксида хлора, а затем этанолом и синим рулоном. Используйте стерильный восьмимиллиметровый биопсийный перфоратор, чтобы вырезать восьмимиллиметровый образец кожи из подготовленного участка. Затем извлеките образец с помощью стерильных щипцов и скальпеля No 15 лезвия, убедившись, что весь кожный жир удален.
Поместите образцы в стерильную 0,5-литровую банку, наполненную стерильным PBS. Затем переложите их в стерильные 50-миллилитровые трубки, заполненные 50 миллилитрами 200 PPM раствора диоксида хлора. Дважды переверните тюбик и оставьте его для стерилизации в течение 30 минут.
Переложите образцы в 50-миллилитровую трубку, заполненную 40 миллилитрами стерильного PBS. После промывки PBS поместите каждый образец кожи в отдельный колодец из 24-луночной пластины. Добавьте 350 микролитров предварительно нагретой среды в лунку, сохраняя при этом образец на границе раздела воздух-жидкость.
Запечатайте 24-луночные пластины газопроницаемым пластинчатым уплотнением перед размещением пластины для инкубации в инкубаторе увлажненной ткани при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. После инкубации удаляют питательную среду и промывают образцы в 500 микролитрах стерильного PBS. Удалите остаточные антибиотики из образца, обрабатывая их средами без антибиотиков при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия в течение 24 часов.
Если мутность или грибковая инфекция развивается в среде, свободной от антибиотиков, выбросьте образец. Далее приготовьте 50-миллилитровый тюбик с 10 миллилитрами стерильного триптического соевого бульона. Затем переложите несколько колоний золотистого стафилококка со свежей агаровой пластины S.aureus в бульон и высиживают трубку при 37 градусах Цельсия и 150 об/мин в течение 18 часов.
После центрифугирования трубок при 4000 Г в течение трех минут удаляют супернатант и повторно суспендируют ячейку гранулы в 10 миллилитрах стерильного PBS. Повторите промывку PBS дважды, прежде чем регулировать инокулятор до оптической плотности 0,6 на длинах волн 600 нанометров с использованием стерильной PBS. Подтвердите нагрузку инокулята с помощью ручного подсчета жизнеспособных пластин.
Чтобы заразить образец кожи, подготовьте свежую 24-луночную пластину с 400 микролитрами предварительно подогретой среды, свободной от антибиотиков, и добавьте 24 лунки с использованием стерильных щипцов. Удалите носитель из образцов кожи. Вымойте их 500 микролитрами стерильного PBS и удалите стирку.
Используйте стерильные щипцы, чтобы аккуратно удерживать образец на дне колодца. Используйте четырехмиллиметровую пунш-биопсию, чтобы проткнуть образец кожи на грубую глубину от одного до двух миллиметров и сделать центральный раневой лоскут. Затем используйте скальпель No 15 лезвия и стерильно-зубчатые тканевые щипцы Allis для удаления верхнего слоя раневого лоскута.
После того, как все образцы будут ранены, переложите их на 24 колодезные вставки с помощью стерильных щипцов. Пипетка 15 микролитров бактериального инокулята в раневое ложе перед инкубацией в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в инкубаторе увлажненной ткани. В течение более длительных инкубационных периодов удаляйте среду, заменяйте ее свежей средой каждые 24 часа и инкубируйте пластины в тех же условиях.
Чтобы определить бактериальную нагрузку, удалите среду со дна лунок. И используя стерильные щипцы, переложить каждый образец в отдельную 50-миллилитровую трубку, заполненную одним миллилитром стерильного PBS. Затем отделите бактерии от поверхности раневого дна путем гомогенизации поверхности образца гомогенизатором с мелким наконечником.
Убедитесь, что раневое ложе находится в непосредственном контакте с кончиком гомогенизатора. После того, как все образцы обработаны, вихрь каждого образца перед переносом 20 микролитров гомогената в соответствующую скважину 96-луночной пластины, содержащей 180 микролитров стерильного PBS. Последовательно разбавляют каждый образец гомогената до 1 раза 10 до отрицательного 7, а пипетку 10 микролитров разбавленного гомогената на триптическую соевую агаровую пластину в трех экземплярах.
Инкубируйте пластину триптического соевого агара при 37 градусах Цельсия, а через 18 часов подсчитайте количество колоний, чтобы определить колониеобразующие единицы или КОЕ для каждого образца. Соответствующий режим стерилизации кожи был идентифицирован с использованием различных методов лечения в течение различных периодов времени. Целостность тканей контролировалась гистологией с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином сразу после лечения.
30-минутная обработка диоксидом хлора была наиболее эффективной процедурой, с воспроизводимой стерилизацией тканей кожи при сохранении целостности тканей. Белая пленка в раневом ложе была очевидна на ткани через 48 часов после заражения. Хотя модель царапин содержала более высокое среднее количество КОЕ через 24 часа, метод удаления лоскута дал более последовательные результаты.
Через 48 часов из раненой ткани было извлечено примерно в 100 раз больше бактериальных КОЕ по сравнению с инокулятом, что указывает на успешную инфекцию. Окрашенные по грам гистологические участки инфицированной ткани указывали на наличие в раневом ложе клеток S.aureus, которые отсутствовали в участках неинфицированной ткани. После этой процедуры можно выполнить иммуногистохимию для изучения реакции тканей, модифицированное окрашивание грамма для визуализации бактериальной локализации и жизнеспособное количество пластин после антимикробного воздействия для проверки антимикробной эффективности.
Для исследователей, разрабатывающих новые противомикробные препараты, эта модель обеспечит больший контроль над оптимизацией свинца, уменьшит зависимость от дорогостоящих и жестко регулируемых испытаний на животных и обеспечит быструю трансляцию противомикробных препаратов в клинику.
