Эта процедура была направлена на удовлетворение потребности в простом и надежном сборе внеклеточных везикул, полученных из мезенхимальных стволовых клеток, и в применении их в трансляции исследований. Сбор внеклеточных везикул методом дифференциального центрифугирования прост, легко масштабируется и воспроизводим, что будет полезно в полевых условиях. Внеклеточные везикулы, неотличимые от неразличимых мезенхимальных стволовых клеток, являются нечетким применением в современных методах лечения заболеваний.
Я не буду бояться ошибок. Эта операция проста и легка в освоении. В этой простой программе есть много деталей, которые можно лучше представить с помощью видео.
Для начала культивируйте мезенхимальные стволовые клетки до более чем 90% слияния. Замените питательную среду в каждой чашке 8 мл добавленного альфа-МЭМ. После 48 часов культивирования клетки должны быть выращены равномерно, чтобы полностью собрать питательную среду в центрифужные пробирки объемом 50 мл.
Затем центрифугируют питательную среду при 800 х г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в конические трубки объемом 1,5 мл для удаления фрагментов клеток и клеточного мусора. Центрифугируйте надосадочную жидкость при 16 000 x g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Используйте пипетку для переноса суспензии в ультрацентрифужные пробирки. Затем центрифугу при 150 000 x g в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Ресуспендируйте гранулы микровезикулы в 50 мкл PBS на блюдо.
Выбросьте надосадочную жидкость и соберите остаток, которым являются экзосомы. Ресуспендируют экзосомы из семи чашек клеток в 50 мкл PBS. В пробирке объемом 15 мл разведите 1 мкл внеклеточных везикул в 1 499 мкл PBS и перемешайте.
Затем запустите совместимое программное обеспечение для анализатора отслеживания. Заполните ячейку образца дистиллированной водой, а затем дайте прибору начать проверку ячейки. Откалибруйте прибор приготовленным стандартным раствором.
Убедитесь, что количество частиц, отображаемое в интерфейсе обнаружения программного обеспечения, составляет от 50 до 400, предпочтительно около 200, и нажмите кнопку «ОК». Затем промойте ячейку образца 5 мл дистиллированной воды. Перед анализом пробы промойте канал 1 мл дистиллированной воды.
Убедитесь, что количество частиц, отображаемое в интерфейсе обнаружения программного обеспечения, меньше 10. В конической трубке объемом 1,5 мл ресуспендируют внеклеточные везикулы с помощью 250 мкл PBS. В другой конической пробирке объемом 1,5 мл приготовьте рабочий раствор красителя PKH26.
Ресуспендированные внеклеточные везикулы смешать с рабочим раствором. Дайте ему постоять при комнатной температуре в течение пяти минут, а затем добавьте 500 мкл FBS, обедненного EV, чтобы остановить реакцию. Для микровезикул центрифугу при 16 000 x g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
Откажитесь от надосадочной жидкости. Добавьте 1 мл PBS, чтобы смыть остатки. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить несвязанный краситель.
Для микровезикул центрифугу при 16 000 x g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспендируйте остаток 200 мкл PBS. Капните 20 мкл суспензии на предметное стекло и наблюдайте ее под флуоресцентным микроскопом.
Ресуспендируют внеклеточные везикулы в 200 мкл PBS, а затем смешивают с раствором гепарина в объемном соотношении 10:1. Поместите мышь в систему визуализации каудальной вены. Нажмите переключатель, чтобы поднять рычаг.
С помощью иллюстратора хвостовой вены выполняют систематическую инъекцию суспензии внеклеточных везикул через хвостовую вену. Анализ распределения частиц по размерам с использованием NTA показал, что размер экзосом из мезенхимальных стволовых клеток человека варьировался от 40 до 335 нм с пиковым размером около 100 нм. Кроме того, размер микровезикул варьировался от 50 до 445 нм, с пиковым размером 150 нм.
Морфологическая характеристика экзосом показала, что они имели типичную чашеобразную форму. Внеклеточные везикулы были эффективно мечены PKH26, что наблюдалось грубым видом в виде меченых гранул, а также с помощью флуоресцентной микроскопии. Оператор должен быть внимателен во время сбора надосадочной жидкости, потому что клетки должны быть равномерно продуты, чтобы полностью собрать высвобожденные ВВ, удерживаемые в нечетких мезенхимальных стволовых клетках.
Чтобы проверить успешность инъекции, может быть выполнена визуализация in vivo биораспределения меченных флуоресценцией EV или замороженных участков определенных тканевых участков приживления.
