عالج هذا الإجراء الحاجة إلى مجموعة حويصلات خارج الخلية مشتقة من الخلايا الجذعية المتوسطة بسيطة وموثوقة ، والتطبيق في ترجمة البحث. إن جمع الحويصلات خارج الخلية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي أمر بسيط وقابل للتطوير بسهولة وقابل للتكرار ، مما سيكون مفيدا لهذا المجال. الحويصلات خارج الخلية غير واضحة}من غير واضحة}الخلايا الجذعية الوسيطة هو تطبيق غير واضح في علاجات الأمراض الحديثة.
لن أخاف من الأخطاء. هذه العملية بسيطة وسهلة التعلم. هناك العديد من التفاصيل في هذا البرنامج البسيط التي يمكن تقديمها بشكل أفضل من خلال الفيديو.
للبدء ، قم بزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة إلى أكثر من التقاء 90٪. استبدل وسط الاستزراع في كل طبق ب 8 مل من ألفا ميم المضاف. بعد 48 ساعة من المزرعة ، يجب أن تنمو الخلايا بالتساوي لجمع وسط الاستزراع بالكامل في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل.
بعد ذلك ، قم بطرد مركزي وسط الاستزراع عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنابيب مخروطية سعة 1.5 مل لإزالة شظايا الخلايا والحطام الخلوي. أجهزة الطرد المركزي طاف في 16،000 × ز لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.
استخدم ماصة لنقل التعليق إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة. ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 150،000 × ز لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الحويصلة الدقيقة في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل طبق.
تخلص من المادة الطافية واجمع البقايا ، وهي إكسوسومات. إعادة تعليق exosomes من سبعة أطباق من الخلايا في 50 uL من PBS. في أنبوب 15 مل ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من الحويصلات خارج الخلية في 1،499 ميكرولتر من PBS واخلطها.
ثم ابدأ تشغيل البرنامج المتوافق لمحلل التتبع. املأ خلية العينة بالماء المقطر ثم اترك الأداة تبدأ فحص الخلية. قم بمعايرة الجهاز بمحلول قياسي معد.
تأكد من أن رقم الجسيمات المعروض على واجهة اكتشاف البرنامج يتراوح بين 50 إلى 400 ، ويفضل أن يكون حوالي 200 ، وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، اشطف خلية العينة ب 5 مل من الماء المقطر. قبل تحليل العينة ، اغسل القناة ب 1 مل من الماء المقطر.
تأكد من أن رقم الجسيمات المعروض على واجهة اكتشاف البرنامج أقل من 10. في أنبوب مخروطي سعة 1.5 مل ، أعد تعليق الحويصلات خارج الخلية ب 250 ميكرولتر من PBS. في أنبوب مخروطي آخر سعة 1.5 مل ، قم بإعداد محلول العمل لصبغة PKH26.
امزج الحويصلات خارج الخلية المعاد تعليقها مع محلول العمل. اتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم أضف 500 ميكرولتر من FBS المستنفد ل EV لإيقاف التفاعل. بالنسبة للحويصلات الدقيقة ، أجهزة الطرد المركزي عند 16،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المادة الطافية. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لشطف البقايا. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، وتجاهل المادة الطافية لإزالة الصبغة غير المنضمة.
بالنسبة للحويصلات الدقيقة ، أجهزة الطرد المركزي عند 16،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق البقايا ب 200 ميكرولتر من PBS. أسقط 20 ميكرولتر من التعليق على الشريحة وراقبها تحت المجهر الفلوري.
أعد تعليق الحويصلات خارج الخلية في 200 ميكرولتر من PBS ، ثم اخلطها بمحلول الهيبارين بنسبة حجم 10: 1. ضع الفأر في نظام تصوير الوريد الذيلي. اضغط على المفتاح لرفع الرافعة.
بمساعدة مصور وريد الذيل ، قم بإجراء حقن منهجي لتعليق الحويصلة خارج الخلية من خلال الوريد الذيل. أظهر تحليل توزيع حجم الجسيمات باستخدام NTA أن حجم الإكسوسومات من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية تراوح من 40 إلى 335 نانومتر ، مع حجم ذروة يبلغ حوالي 100 نانومتر. أيضا ، تراوح حجم الحويصلات الدقيقة من 50 إلى 445 نانومتر ، مع حجم ذروة 150 نانومتر.
أظهر التوصيف المورفولوجي للإكسوسومات أنها أظهرت شكل كوب نموذجي. تم تصنيف الحويصلات خارج الخلية بكفاءة بواسطة PKH26 ، والتي لوحظت من خلال العرض الإجمالي على أنها كريات موسومة ، وكذلك بواسطة المجهر الفلوري. يجب على المشغل الانتباه أثناء جمع الخلايا الطافية ، لأنه يجب نفخ الخلايا بالتساوي لجمع EVs المفرج عنها بالكامل في الخلايا الجذعية الوسيطة غير الواضحة.
من أجل التحقق من نجاح الحقن ، يمكن إجراء التصوير في الجسم الحي للتوزيع الحيوي للمركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية أو الأقسام المجمدة لمواقع الأنسجة المحددة للتطعيم.
