Bu prosedür, basit ve güvenilir mezenkimal kök hücre kaynaklı hücre dışı vezikül toplama ve araştırmanın çevirisinde uygulama ihtiyacını ele almıştır. Diferansiyel santrifüjleme ile hücre dışı veziküllerin toplanması basit, kolayca ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir, bu da alan için yararlı olacaktır. Hücre dışı veziküller belirsiz}den belirsiz}mezenkimal kök hücre, modern hastalık tedavilerinde belirsiz bir uygulamadır.
Hatalardan korkmayacağım. Bu işlem basit ve öğrenmesi kolaydır. Bu basit programda video yoluyla daha iyi sunulabilecek birçok ayrıntı var.
Başlamak için, mezenkimal kök hücreleri% 90'dan fazla birleşime kültürleyin. Her yemekteki kültür ortamını 8 mL takviyeli alfa-MEM ile değiştirin. 48 saatlik kültürden sonra, kültür ortamını 50 mL santrifüj tüplerine tamamen toplamak için hücreler eşit şekilde büyütülmelidir.
Ardından, kültür ortamını 800 x g'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre parçalarını ve hücresel kalıntıları çıkarmak için süpernatantı 1.5 mL konik tüplere aktarın. Süpernatantı 16.000 x g'de dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin.
Süspansiyonu ultrasantrifüj tüplerine aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra, dört santigrat derecede iki saat boyunca 150.000 x g'de santrifüj. Mikro-parçacıklı peleti çanak başına 50 uL PBS'de tekrar askıya alın.
Süpernatantı atın ve eksozomlar olan kalıntıyı toplayın. Eksozomları 50 uL PBS'deki yedi hücre kabından yeniden askıya alın. 15 mL'lik bir tüpte, 1.499 uL PBS'de 1 uL hücre dışı vezikülü seyreltin ve karıştırın.
Ardından, izleme analizörü için uyumlu yazılımı başlatın. Numune hücresini damıtılmış suyla doldurun ve ardından cihazın hücre kontrolünü başlatmasına izin verin. Cihazı hazırlanmış bir standart çözelti ile kalibre edin.
Yazılım algılama arabiriminde görüntülenen parçacık numarasının 50 ila 400 arasında, tercihen 200 civarında olduğundan emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Daha sonra, numune hücresini 5 mL damıtılmış su ile durulayın. Numune analizinden önce, kanalı 1 mL damıtılmış su ile yıkayın.
Yazılım algılama arabiriminde görüntülenen parçacık numarasının 10'dan az olduğundan emin olun. 1.5 mL'lik bir konik tüpte, hücre dışı vezikülleri 250 uL PBS ile yeniden askıya alın. Başka bir 1.5 mL konik tüpte, PKH26 boyasının çalışma çözeltisini hazırlayın.
Askıya alınmış hücre dışı vezikülleri çalışma çözeltisi ile karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika bekletin ve ardından reaksiyonu durdurmak için 500 uL EV tükenmiş FBS ekleyin. Mikro-parçacıklar için, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj.
Supernatan'ı atın. Kalıntıyı durulamak için 1 mL PBS ekleyin. Tekrar santrifüj yapın ve bağlanmamış boyayı çıkarmak için süpernatantı atın.
Mikro-parçacıklar için, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj. Kalıntıyı 200 uL PBS ile yeniden askıya alın. Slaytın üzerine 20 uL süspansiyon bırakın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Hücre dışı vezikülleri 200 uL PBS'de yeniden askıya alın ve daha sonra 10: 1 hacim oranında heparin çözeltisi ile karıştırın. Fareyi kaudal ven görüntüleme sistemine yerleştirin. Kolu kaldırmak için düğmeye basın.
Bir kuyruk damarı illüstratör yardımıyla, hücre dışı vezikül süspansiyonunun kuyruk damarından sistematik bir enjeksiyonunu gerçekleştirin. NTA kullanılarak partikül boyutu dağılımının analizi, insan mezenkimal kök hücrelerinden gelen eksozomların boyutunun, yaklaşık 100 nm'lik bir tepe boyutu ile 40 ila 335 nm arasında değiştiğini göstermiştir. Ayrıca, mikro-parçacıkların boyutu, tepe boyutu 150 nm olan 50 ila 445 nm arasında değişmiştir.
Eksozomların morfolojik karakterizasyonu, tipik bir fincan şekli sergilediklerini göstermiştir. Hücre dışı veziküller, etiketli peletler olarak brüt görünüm ve floresan mikroskopi ile gözlemlenen PKH26 tarafından etkili bir şekilde etiketlendi. Operatör süpernatant toplama sırasında dikkat etmelidir, çünkü mezenkimal kök hücrelerin belirsizliğinde tutulan serbest bırakılan EV'leri tam olarak toplamak için hücreler eşit şekilde üflenmelidir.
Enjeksiyonun başarısını doğrulamak için, floresan etiketli EV'lerin biyodağılımının in vivo görüntülemesi veya engraftmanın spesifik doku bölgelerinin dondurulmuş bölümleri yapılabilir.
