Esse procedimento abordou a necessidade de coleta simples e confiável de vesículas extracelulares derivadas de células-tronco mesenquimais e de aplicação em tradução de pesquisa. A coleta de vesículas extracelulares por centrifugação diferencial é simples, facilmente escalável e reprodutível, o que será útil ao campo. Vesículas extracelulares indistintas de células-tronco mesenquimais indistintas é uma aplicação indistinta no tratamento de doenças modernas.
Não terei medo de erros. Esta operação é simples e fácil de aprender. Há muitos detalhes neste programa simples que podem ser melhor apresentados através de vídeo.
Para começar, cultivar as células-tronco mesenquimais para mais de 90% de confluência. Substitua o meio de cultura em cada placa por 8 mL de alfa-MEM suplementado. Após 48 horas de cultivo, as células devem ser cultivadas uniformemente para coletar completamente o meio de cultura em tubos de centrífuga de 50 mL.
Em seguida, centrifugar o meio de cultura a 800 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante para tubos cônicos de 1,5 mL para remover os fragmentos celulares e debris celulares. Centrifugar o sobrenadante a 16.000 x g durante 30 minutos a quatro graus Celsius.
Use uma pipeta para transferir a suspensão para tubos ultracentrífugos. Em seguida, centrifugar a 150.000 x g por duas horas a quatro graus Celsius. Ressuspender o pellet de microvesícula em 50 uL de PBS por prato.
Descarte o sobrenadante e colete o resíduo, que são os exossomos. Ressuspender os exossomos de sete placas de células em 50 uL de PBS. Em um tubo de 15 mL, diluir 1 uL de vesículas extracelulares em 1,499 uL de PBS e misturar.
Em seguida, inicie o software compatível para o analisador de rastreamento. Encha a célula de amostra com água destilada e, em seguida, permita que o instrumento inicie a verificação da célula. Calibrar o instrumento com uma solução padrão preparada.
Verifique se o número de partículas exibido na interface de detecção de software está entre 50 e 400, de preferência em torno de 200, e clique em OK. Em seguida, enxaguar a célula da amostra com 5 mL de água destilada. Antes da análise da amostra, lave o canal com 1 mL de água destilada.
Verifique se o número de partículas exibido na interface de detecção de software é menor que 10. Em um tubo cônico de 1,5 mL, ressuspenda as vesículas extracelulares com 250 uL de PBS. Em outro tubo cônico de 1,5 mL, prepare a solução de trabalho do corante PKH26.
Misture as vesículas extracelulares ressuspensas com a solução de trabalho. Deixe repousar à temperatura ambiente por cinco minutos e, em seguida, adicione 500 uL de FBS esgotado de EV para interromper a reação. Para microvesículas, centrifugar a 16.000 x g durante 30 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante. Adicionar 1 mL de PBS para enxaguar o resíduo. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante para remover o corante não ligado.
Para microvesículas, centrifugar a 16.000 x g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspender o resíduo com 200 uL de PBS. Soltar 20 uL de suspensão sobre a lâmina e observá-la sob um microscópio de fluorescência.
Ressuspender vesículas extracelulares em 200 uL de PBS e, em seguida, misturar com solução de heparina em uma relação de volume de 10:1. Coloque o mouse no sistema de imagem da veia caudal. Pressione o interruptor para levantar a alavanca.
Com a ajuda de um ilustrador da veia da cauda, realize uma injeção sistemática da suspensão da vesícula extracelular através da veia da cauda. A análise da distribuição granulométrica utilizando NTA demonstrou que o tamanho dos exossomos das células-tronco mesenquimais humanas variou de 40 a 335 nm, com um pico de cerca de 100 nm. Além disso, o tamanho das microvesículas variou de 50 a 445 nm, com um tamanho de pico de 150 nm.
A caracterização morfológica dos exossomos mostrou que eles exibiram uma forma típica de taça. As vesículas extracelulares foram eficientemente marcadas por PKH26, o que foi observado pela visão grosseira como pellets marcados, bem como por microscopia fluorescente. O operador deve prestar atenção durante a coleta do sobrenadante, porque as células devem ser sopradas uniformemente para coletar completamente os EVs liberados retidos nas células-tronco mesenquimais indistintas.
A fim de verificar o sucesso da injeção, imagens in vivo da biodistribuição de EVs marcados com fluorescência ou cortes congelados de sítios específicos de enxertia tecidual podem ser realizadas.
