Этот протокол показывает создание большого краниального окна для измерения широкоугольных и одноклеточных действий резервирования в одной мыши. Используя наш метод, большое и стабильное краниальное окно может быть изготовлено с пищевой пленкой по низкой цене. Этот метод эффективен для изучения нейронной и глиальной деятельности во время поведения на макроскопическом и микроскопическом уровнях.
Начинать рекомендуется с небольшого черепного окна. Затем, если это удалось, увеличьте размер окна. Начните с удаления лишнего цемента над черепом с помощью бормашины.
Пометьте область, которую нужно вырезать, ручкой. Врежьте в кость скальпелем с тупым кончиком, чтобы наконечник не проник в череп. Соскребайте кость несколько раз скальпелем, чтобы углубить бороздку, пока кость в области, подлежащей обрезке, не сдвинется при легком прикосновении.
Удалите разрезанную кость тонким пинцетом. Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть костный лоскут в мозг, который может повредить мозг. Чтобы удалить твердую мозговую оболочку, отрежьте твердое вещество с помощью вытянутой стеклянной пипетки с коническим наконечником около 10 микрометров.
Используйте U-образную иглу, чтобы расширить этот разрез по всему окну. Под стереомикроскопом, установленным на 60-100-кратный зум, удалите отрезанную твердую мозговую оболочку с помощью ультратонкого пинцета. В случае кровотечения смойте с помощью aCSF или используйте желатиновую губку, чтобы остановить кровотечение.
Затем стерилизуйте большой кусок pvdc-пленки путем автоклавирования и 70% этанола. Под стереомикроскопом используйте пинцет и скальпель, чтобы вырезать обертку необходимого размера. Поместите обертку на поверхность мозга, оставив aCSF на поверхности.
Высасывайте aCSF с края обертывания, позволяя обертке прочно прилипать к поверхности мозга. Обрежьте обертку скальпелем и пинцетом так, чтобы между краем краниального окна и оберткой было примерно одно миллиметровое поле. Как только обертка будет на месте, приклейте край обертывания к черепу биологическим клеем.
Дайте клею высохнуть в течение примерно 30 минут. Используя дозатор со смесительным наконечником, нанесите прозрачный силиконовый эластомер поверх обертки. Поместите сверху покровное стекло толщиной от 0,12 до 0,17 миллиметра.
Запечатайте периметр покровного стекла водонепроницаемой пленкой, суперклеем или зубным цементом. Сначала смешайте растворы фиброина и AAV в соотношении от одного до четырех в небольшой пробирке. Капните аликвоту раствора на полиэтиленовую пленку для краниального окна и высушите ее не менее трех часов.
Затем прикрепите обертку к поверхности мозга, как показано в предыдущем разделе. Проверяйте состояние мышей и окон регулярно, от двух до четырех недель. К этому времени генетически закодированные показатели кальция будут достаточно выражены после создания окна, обработанного AAV.
Используя этот протокол, краниальные окна могут поддерживаться у восьми из 10 мышей в течение 10 недель. Широкое окно создается полиэтиленовой пленкой, прозрачным силиконом и закрытым стеклом в трансгенной мыши, экспрессирующей мембранно-закрепленный генетически закодированный показатель кальция в астроцитах. Через это окно была выполнена широкоугольная визуализация кальция, и флуоресцентные изменения наблюдались при применении стимуляции воздушной затяжки к контралатеральным усам.
Временной ход изменения флуоресценции в соматосенсорной коре показал корковую активность. Двухфотонная визуализация позволила наблюдать изображения флуоресценции одиночных клеток, специфичные для глиальных клеток. Флуоресцентные изменения, индуцированные сенсорной стимуляцией, наблюдались в отдельных клетках из разных областей коры.
Обертка, закодированная AAV, экспрессирующим генетически закодированный индикатор кальция; и фиброин использовался для создания краниального окна. Широкоугольная визуализация кальция показала кортикальную активность, распространяющуюся по коре, вызванную сенсорной стимуляцией через две-четыре недели после операции. Поскольку окно было большим, различные области коры одной и той же мыши были изображены, и флуоресцентные изменения, вызванные сенсорной стимуляцией, были замечены в отдельных клетках.
Важно избегать повреждения головного мозга при изготовлении краниального окна. Можно выполнять задачи поведения на мышах с большим краниальным окном. Это позволит изучить взаимосвязь между нейронной активностью и поведением мыши.
Этот метод может быть применен к различным исследованиям в области неврологии. Например, его можно использовать для наблюдения за активностью коры во время принятия решений, двигательного бега, а также в массовых моделях черепно-мозговых травм и заболеваний.
