Нижняя оливка является наиболее брюшной частью медуллы, и, таким образом, чрезвычайно трудно достичь в живом животном. Здесь мы вводим протокол, чтобы разоблачить мозг взрослой мыши стволовых от брюшной стороны, и использовать линзы GRIN для записи нейронной активности в нижних оливковых нейронов, выражаюющих датчики кальция. Этот метод позволяет избежать повреждения критически важного для жизни ствола мозга, а также позволяет проводить исследования пространственно-временных моделей активности и входной интеграции в нижняя оливка.
Так как операция проводится в сложной области горла со многими жизненно важными структурами, важно, чтобы она проводится исследователем с высоким уровнем хирургических навыков. Подготовьте иноатную трубку, разрезая прорезь длиной от 5 до 6 миллиметров и шириной 0,8 миллиметра с кончика 20-го калибровного катетера. Подготовь тупую и изогнутую иглу, отрезав кончик, отшлифовав поверхность перелома и согните ее плоскогубцами.
Это будет использоваться для поддержки трахеи во время трахеотомии. Разбавить 15 миллиграмм на миллилитр кетамина с солевым раствором до 15%Собрать хирургические инструменты и расходные материалов. Установите грелку до 38 градусов по Цельсию.
Поверните nosecone 180 градусов горизонтально в стереотаксисной раме. Взвесьте мышь, чья нижняя оливка ранее была трансфицирована вирусосущей GCaMP6s, и рассчитать количество разбавленного кетамина для инъекций. Предварительно заполнить индукционный ящик с 5%isoflurane, и анестезировать мышь.
Намонтайте мышь в стереотаксисной раме, вентраль стороной вверх. Бритье мыши горла и бедра области. Удалите остаточные волосы кремом для удаления волос.
Местно нанесите ксилокаин желе на кожу горла. Мониторинг температуры мыши с помощью ректального теплового датчика. Ввимите один миллилитр предварительно разогретый солевой интраперитонически.
Оцените глубину анестезии сильным щепоткой на задних лапах. Не следует вызывать никаких обнаруживаемых ответов. Сделайте вертикальный разрез в коже горла вдоль средней линии.
Отделить кожу шеи от внутренностей под ним с помощью метода тупого вскрытия и отрезать кожу. Бесплатные слюнные железы из соединительной ткани, и перевернуть их сбоек, чтобы разоблачить стернотиреоидных мышц покрытых трахеей. Интраперитонально вводят первую дозу разбавленного кетамина по пять миллилитров на килограмм веса животного.
Тщательно разделить стернотиреоид мышцы вдоль средней линии с кончиком тонкой типсов подвергать трахеи. Отсоедините трахею от кровеносных сосудов и пищевода с помощью типсов с помощью метода тупого вскрытия. Ввимите вторую дозу разбавленного кетамина при 2,5 миллилитрах на килограмм веса животного.
Поперечно вставьте тупую иглу под трахею. Поднимите трахею тупой иглой. Сделать шов нить идти вокруг третьего кольца трахеи, caudal щитовидной железы, с половиной круга иглы.
Сделайте четыре инструментальных галстука на этом кольце. Пирс груди кожи с той же иглой полукруг и привести нить через кожу. Аккуратно поднимите трахею нитью и вырежьте трахею хвостом к щитовидной железе.
Потяните трахею к коже груди. Поднимите отверстие трахеи, добавив небольшой кусочек хирургической губки под ним. Удалите оставшуюся жидкость внутри открывающейся кончика трахеи тонкой полоской чистящих тканей.
Переключите изофлюранный поток из стереотаксийного носовогоона в инубную трубку. Вставьте инобубную трубку в трахею. Убедитесь, что часть щели в трубке остается за пределами трахеи, чтобы дышать.
Исправить трахеи для мыши груди кожи, сделав три-четыре инструмента связей. Свяжите трахею с шовной нитью, чтобы обеспечить иноподабительный трубки. Разрежьте стернотиреоидную мышцу вдоль мышечных волокон с помощью тонких типсов.
Отрежьте изолированную часть с ножницами весны. Тщательно освободите остатки трахеи и гортани от мышц, чтобы свести к минимуму повреждение кровеносных сосудов в мышцах. Удалите остатки трахеи и гортани.
Освободите пищевод от прикрепленной ткани с типсами и отрежьте его весенними ножницами. Удалите продольную мышцу, покрывающую ствол мозга и вентраловую арку атласа. Удалите мышцы, покрывающие атласную вентрал арку и переднюю клубень.
Вырезать вентрал арки атласа с rongeur. Удалите переднюю клубень атласа. Удалите кровь и жидкость для просмотра foramen magnum и ствол мозга.
Расширьте foramen magnum путем извлекать затылчной костоно с rongeur. Удалите хрящ, и тщательно очистить периостейный слой dura mater с тонкой тибры, чтобы иметь четкое представление о брюшной ствол мозга. Зажим датчик SpO2 на бедре мыши для мониторинга жизненно важных признаков, таких как частота сердечных сокращений, насыщение кислородом, и частота дыхания.
Намонтировать объектив GRIN на имплантативной штанге. Тщательно очистите объектив 70%-ной тканью очистки, пропитанной этанолом. Зафиксировать имплантатный стержень на стереотаксисной раме и установить миниатюрный микроскоп на имплантативный стержень.
Добавьте несколько капель солевого раствора в область ствола мозга для погружения в объектив GRIN. Подойди к стволу мозга с помощью объектива GRIN. GCaMP6s, выражающих нижние оливковые нейроны в поверхностной области, можно найти в области прямоугольной формы, от 0,5 до 1,7 миллиметра рострального к оставшемуся атласу, и от 2,6 до 1,1 миллиметра боковой к средней линии.
Включите возбуждение синий светодиод в миниатюрном микроскопе, чтобы найти GCaMP6s трансфицированных нижних оливковых нейронов. Нейроны показывают различную базовую интенсивность флуоресценции из-за различных уровней экспрессии GCaMP6s. Изменение уровня кальция кружили нижней оливкового нейрона сомата в видео слева будет показано нам дельта F разделены F следы справа.
Хотя мышь хранится теплой и увлажненной, она неизбежно будет ослаблена длительной анестезией и хирургией. Важно, чтобы сохранить продолжительность операции короткий так мыши физическое состояние будет хорошо для записи. Квалифицированный исследователь может закончить операцию за 70 минут.
Этот метод, с модификациями, может быть использован для изучения других смежных областей брюшной ствол мозга.
