Роль микроглии в гиппокампе еще не до конца изучена. Этот протокол может непосредственно визуализировать, как микроглия контактирует и регулирует нейроны. Визуализация in vivo покоящихся микроглии и нейронов в гиппокампе была очень сложной.
Этот метод может решить эту проблему. Чтобы имплантировать смотровое окно, сделайте трехмиллиметровую круговую канавку на черепе с помощью дермального пуансона, обеспечив выравнивание бороздки с ранее отмеченной областью. Когда дермальный пуансон достигнет самого внутреннего слоя черепа, прежде чем коснуться нижележащей твердой мозговой оболочки, осторожно поднимите центральный костный остров с помощью иглы 30 калибра.
Далее осторожно удалите твердую мозговую оболочку с помощью подборщика твердой мозговой оболочки. Аспирируйте мягкую пищу, пиальные сосуды и корковую ткань с поверхности. Сохраняйте глубину открытой поверхности тканей однородной по всему черепному окну и постепенно углубляйте аспирацию до тех пор, пока волокна внешней капсулы не обнажаются.
После размещения всасывающего наконечника к внешней капсуле рядом с боковым желудочком на ростролатеральном конце черепного окна удалите поверхностный слой наружной капсулы, идущий в хвостомедиальном направлении в ростролатеральном направлении. Затем снимите внутренний слой, идущий в медиолатеральном направлении. Подтвердите удаление всей наружной капсулы, проверив полное обнажение поверхности альвеуса и дорсальной спайки гиппокампа.
Убедившись, что кровотечение полностью остановилось, заполните отверстие стерильным физиологическим раствором до уровня поверхности черепа. Затем вставьте металлическую трубку со стеклянным дном вертикально в отверстие, всасывая лишнюю воду, переливающуюся со сторон трубки, пока стеклянное дно не слегка прижмется к альвеусу и частично не сплющет нижележащий CA1. Используя цемент из стоматологической смолы, закрепите стенку вставленной трубки к окружающему черепу.
Установите мышь в устройство для удержания головы под линзой объектива двухфотонного микроскопа и на моторизованном сканирующем столике XY. Затем заполните пространство между дном стекла и линзой объектива водой, не создавая пузырьков воздуха. Отрегулируйте фокус на CA1 с помощью флуоресценции, излучаемой паренхимой головного мозга, и отраженного света от края металлической трубки при непрерывном освещении импульсным лазером.
Отрегулируйте угол наклона головы мыши, наклонив устройство удержания головы так, чтобы дно стекла было параллельно плоскости изображения. Затем отрегулируйте корректирующий воротник объектива для достижения наибольшего разрешения на глубине целевой структуры в CA1. Затем подтвердите, что флуоресцентные клетки в молекулярном слое зубчатой извилины или DG на глубине 500 микрометров от дна стекла изображены во всем поле зрения.
Только в случае успешной операции сигналы DG могут быть обнаружены немедленно. Выращивают послеоперационную мышь в индивидуальном жилье в течение нескольких недель. Поместите анестезированную мышь под двухфотонный микроскоп.
Выполните визуализацию гиппокампа. Подтвердите, являются ли качество и интенсивность изображений, полученных после уменьшения послеоперационного отека, лучше или сопоставимы с теми, которые были получены в день операции. Убедитесь, что микроглия восстановила свою разветвленную морфологию.
Затем выполните визуализацию in vivo на интересующем слое в CA1. Микроглия у мышей CX3CR1-GFP, захваченная сразу после операции, не показала заметной активации. После успешного хирургического вмешательства без индукции отека глубина двухфотонной визуализации превысила все слои CA1 и достигла 500 микрометров от операционной поверхности.
Микроглия в хронической фазе более трех недель после операции показала более высокую интенсивность и разрешение флуоресценции и более однородное распределение из-за уменьшения отека и воспаления. Микроглия во всех слоях уже восстановила свою разветвленную морфологию и показала неподвижные клеточные тела и высокомодальные процессы. Изображения с высоким разрешением по всему CA1 предоставлялись в течение нескольких месяцев.
Сигналы от флуоресцентной микроглии помогают идентифицировать слои гиппокампа. Микроглия в альвеусе имела вытянутые клеточные тела и отростки, простирающиеся вдоль аксональных ходов. Микроглии в пирамидальном слое можно отличить по меньшей плотности их отростков.
Граница между CA1 и DG может быть распознана по толстым кровеносным сосудам, идущим вдоль границы, что было лучше распознано путем маркировки сосудов сульфорходамином 101. В качестве примера применения одновременно были визуализированы GFP-положительная микроглия и меченые tdTomato пирамидальные нейроны. Нейронная маркировка помогла понять точные слоистые структуры CA1.
Наиболее важным моментом является уменьшение повреждений от операции. Избегайте повреждения тканей аспирацией. Применяйте мягкое давление при вставке стеклянного дна и избегайте прикосновения зубного цемента к поверхности мозга.
Такой подход поможет выявить роль микроглии в гиппокампе. Например, как микроглия взаимодействует с нейронами, как они участвуют в обучении и как они контролируют заболевания мозга.
