Протокол описывает, как выполнять вирусные инъекции и имплантировать черепное окно для визуализации клеток мозга у бодрствующих мышей с ограничением головы. Преимущество этого метода заключается в том, что структура и активность нейронов и астроцитов могут быть изображены многократно в течение нескольких сеансов. Этот подход может быть использован для определения того, как нейронные клетки изменяются в моделях нейроразвития или нейродегенеративных расстройств, или нарушается ли зависимая от опыта пластичность.
Начните с крепления анестезированной мыши к стереотаксической рамке с помощью зажима морды и ушных вкладышей. Используя стерильные хирургические инструменты, вырежьте и удалите кожу от лобных швов перед брегмой до задней части до лямбды. Используя стерильный хирургический клинок из углеродистой стали 11, аккуратно соскоблите всю соединительную ткань с черепа.
С помощью бормашины постепенно сверлите кость черепа вдоль контура отверстия концентрическими кругами, чтобы облегчить равномерное истончение кости. После каждого концентрического прохода добавляйте каплю или две соляного раствора в пробуренную область и дайте солю в течение не менее 10 секунд, прежде чем возобновить бурение. Осторожно надавите на центральную область кости черепа тонкими щипцами, чтобы проверить, что череп достаточно истончен и двигается.
Убедитесь, что подлежащая сосудистая система, в которой произошло сверление, неповреждена, и что кость не треснула. Осторожно вставьте миниатюрное 15-градусное заостренное лезвие в истонченную кость и вырежьте и используйте гелевую пену, смоченную в физиологическом растворе, чтобы остановить любые кровотечения, которые могут возникнуть. Используя щипцы, осторожно поднимите и удалите кость, заботясь о том, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку.
Для инъекции наполните стерильную скошенную стеклянную пипетку 20-микрометровым наконечником с вирусной смесью. Затем опустите пипетку, чтобы коснуться поверхности мозга, и продолжайте опускаться в течение дополнительных 200-300 микрометров для инъекций слоя 2/3. Используя внутриклеточную систему дозирования микроинъекций, давление вводится в систему от 12 до 15 раз в течение двух минут.
Для имплантации черепного окна поместите покровное стекло над отверстием в черепе. Используйте щипцы, чтобы убедиться, что стекло находится заподлицо над отверстием. Чтобы запечатать края стеклянного окна к черепу, нанесите цианоакрилатный клейкий гель по периметру поверхности стекла.
Поверх клеевого геля нанесите слой клея. Затем добавьте слой зубного цемента в жидкость. Когда зубной цемент затвердеет, нанесите тонкий слой клея вокруг центрального отверстия головной пластины вертолетного типа и поместите пластину головки вертолетного типа соответствующего размера над покровным стеклом.
Дайте клею высохнуть. Добавьте порошок зубного цемента в 1,5-миллилитровую микрофьюжную трубку до отметки 0,1 миллилитра. Смешайте семь-восемь капель быстро отверждающегося мгновенного клея в порошок и втяните полученную смесь в шприц длиной в один миллилитр с помощью иглы 19 калибра, которая была разрезана для создания большего отверстия.
Впрыскивайте порошковую смесь через боковые отверстия вертолетного стержня до тех пор, пока она не просочится с обеих сторон. Нанесите клеевую смесь зубного цемента на остальную часть открытого черепа, чтобы закрепить головную пластину к черепу. Заверните мышь в ткань и закрепите ее через головную пластину к рычагу фиксации головы поднятой по воздуху домашней клетки, а затем оставьте домашнюю клетку подверженной воздействию света.
После 15 минут привыкания выньте мышь из домашней клетки. Используя широкоугольный режим микроскопа, выберите два-три положения легко идентифицируемой сосудистой системы. Сохраните изображения кровеносных сосудов и запишите координаты x и y, которые появляются на контроллере двигателя.
Изображение синаптических структур нейронов и активности GCaMP6f в астроцитах. В репрезентативном анализе качество черепного окна оценивали с помощью повторной визуализации дендритов и GCaMP6f-экспрессирующих астроцитов в течение нескольких дней. В хорошем окне нейронные структуры казались четкими с хорошо видимыми дендритными шипами.
Два новых шипа появились на второй день визуализации. Только один позвоночник сохранялся и был виден на пятый день. Активность кальция изучали в астроцитах, экспрессирующих GCaMP6f в разные моменты времени.
Глобальное событие, охватывающее всю клетку, было засвидетельствовано во время локомоционного поединка. Двумя критическими шагами этого протокола являются то, что кость должна быть адекватно истончена до удаления кости и правильное размещение покровного стекла над отверстием. Визуализация может быть объединена с поведенческим анализом, либо во время визуализации, либо после поведения, таким как изучение нового двигательного навыка, чтобы определить, как нейронная и астроцитарная структура и функция модулируются обучением.
