Этот метод визуализации клеток сетчатки in vivo позволяет исследовать офтальмологические заболевания и понимать нормальные функции сетчатки. Этот метод обеспечивает простой и высоковоспроизводимый подход к визуализации in vivo сетчатки с помощью двухфотонной микроскопии. Правильная стабилизация мыши является ключом к получению качественных изображений in vivo.
Потренируйтесь установить мышь в держатель головы и освойтесь с процедурой, прежде чем пытаться получить изображения. Успокаивайте животное в соответствии с утвержденным протоколом использования животных. Нанесите раствор для расширения зрачков и оставьте мышь в темноте на пять минут, чтобы дать зрачкам расшириться.
Закрепите штифт нижнего слухового прохода в расширенном положении внутрь и штифт верхнего слухового прохода в отведенном положении. Поверните основной рычаг головного держателя до тех пор, пока наушник не будет наклонен под углом 60 градусов ниже горизонтали. Повернув мышь лицом к перекладине укуса, установите одно ухо на расширенный нижний штифт со штифтом, вставленным в ушной канал.
После ослабления винта, закрепляющего штифт верхнего слухового прохода, протяните штифт в другой ушной канал и повторно затяните винт, чтобы закрепить головку. Убедитесь, что мышь надежно закреплена в держателе головы. Нажмите на верхнюю часть головы.
Мышь должна надежно держаться в ушных перекладинах, а ее голова должна свободно вращаться вокруг оси ушных каналов. Расположив стержень укуса по направлению к голове мыши, осторожно поднимите головку мыши, чтобы позволить верхнечелюстным резцам быть опущенными в держатель для укуса, и оттяните штангу укуса с мягкой силой, чтобы закрепить голову. Используйте винт, чтобы закрепить стержень прикуса в нужном положении, и поместите мышь и держатель на ступень микроскопа.
Нанесите смазочные глазные капли на оба глаза мыши. Поверните основной рычаг головного держателя до тех пор, пока зрачок одного глаза не будет ориентирован в соответствии со световым трактом, и поместите в компактный фильтродержатель крышку с цифрой 1,5. После закрепления держателя на ступени микроскопа опустите крышку до тех пор, пока она не соприкоснется со смазочным гелем для глаз, не касаясь роговицы, и отрегулируйте ступень в измерении X-Y и объективном Z-положении до тех пор, пока широкоугольный свет возбуждения полностью не охватит роговицу.
Используйте окуляр, чтобы продолжать корректировать Z-положение до тех пор, пока флуоресцентные клетки или структуры в сетчатке не попадут в фокус, увеличивая эпифлуоресцентный осветитель по мере необходимости для разрешения отдельных клеток или структур, представляющих интерес. Тонкая настройка выравнивания сетчатки с траекторией освещения изображения. Регулируйте угол наклона головки до тех пор, пока при изменении фокальной плоскости не произойдет только расширение или сжатие света, расфокусированного, сводя к минимуму искажения X-Y.
Затем выключите эпифлуоресцентный осветитель и закройте затвор осветителя. Для двухфотонной визуализации следуйте всем институциональным протоколам лазерной безопасности. Выключите и закройте весь окружающий свет и переключите путь света возбуждения на лазер и путь излучения света на PMT.
В программном обеспечении для получения изображений установите размер кадра 512 на 512, а среднее значение кадра — три. Установите Z-шаг, чтобы начать с верхней части стека и двигаться вниз, сводя к минимуму двухфотонную лазерную активацию фоторецепторов. Включите и включите PMT и отрегулируйте напряжение до 680 вольт.
Включите затворы для изображения и излучения. Начните предварительный просмотр целевой ткани в режиме реального времени, начиная с 1% мощности лазера, и автоматически отрегулируйте яркость дисплея, чтобы визуализировать интересующие клетки или структуры. Если ткань-мишень тусклая или неясная, увеличивайте процент мощности лазера до тех пор, пока структуры не станут видимыми, не превышая 45 милливатт.
Маневрируйте ступенью микроскопа в направлении X-Y, чтобы сосредоточиться на желаемой области визуализации, и перейдите к Z-плоскости с интересующими структурами в фокусе. Для хронического покадрового эксперимента откройте ранее полученное изображение для использования в качестве ориентира для интересующих клеток, позаботившись о том, чтобы угол изображения в текущем изображении был аналогичен углу предыдущих изображений. Затем перейдите к верхней и нижней Z-плоскостям, представляющим интерес, чтобы установить Z-пределы стека изображений и получить изображение.
Когда все изображения будут получены, отключите PMT и лазерный затвор. Переключите световой путь возбуждения на эпифлуоресцентное освещение и путь излучения света обратно к окуляру. Затем выйдите из программного обеспечения для сбора изображений, выключите лазер в интерфейсе компьютера и выключите оборудование в обратном порядке запуска, за исключением постоянно включенного оборудования.
В конце анализа извлеките мышь из держателя головы и используйте безворсовую ткань, чтобы аккуратно удалить гель для глаз. Затем нанесите смазочную глазную мазь на оба глаза и поместите мышь на грелку с циркуляцией теплой воды при температуре 37 градусов цельсия с контролем до полного лежания, прежде чем вернуть мышь в ее корпус. У мышей VGlut-2-Cre сомы ганглиозных клеток сетчатки хорошо различимы, а аксонные фасцикулы часто проявляются.
Траектория аксонов и негативное изображение сосудистой системы облегчает идентификацию головки зрительного нерва у мышей VGlut-2-Cre, что полезно в качестве ориентира в экспериментах с хронической визуализацией. В отличие от ганглиозных клеток сетчатки, нейриты амакриновых клеток чаще наблюдаются во внутренних плексиформных слоях. Через день после внутриглазной инъекции NMDA микроглия сетчатки демонстрирует короткие процессы или морфологию амебоидов в соответствии с предыдущими отчетами.
Доставка синего красителя Эванса с помощью одной внутрибрюшинной инъекции за 30-60 минут до визуализации вызывает сильную маркировку кровеносных сосудов, исходящих из головки зрительного нерва, которая сохраняется в течение не менее семи дней. После фиксации истинное расстояние между парами клеток в сплющенных целых креплениях сетчатки может быть измерено в конфокальном сканировании и сопоставлено с расстояниями пикселей in vivo для определения среднего размера пикселей изображений in vivo. Флуоресцентные микросферы, вводимые в глаза мышей, позволяют измерять диаметр микросферы in vivo, давая немного большую оценку размера пикселя, но с большей дисперсией.
Визуализация in vivo может сочетаться с гистологическими анализами, такими как иммуноокрашивание и гибридизация in situ. Эти методы могут идентифицировать конкретные типы клеток и исследовать экспрессию генов изображенных клеток.
