Протокол позволяет исследователям одновременно измерять кальциевую реакцию в первичных Т-клетках, а также оценивать их подмножество и поверхностный фенотип. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет избежать необходимости изолировать определенные подмножества клеток перед изучением их кальциевых реакций. Для начала приготовьте один микрограмм на микролитр исходного раствора Indo-1 AM, добавив 50 микролитров DMSO во флакон, содержащий 50 микрограммов Indo-1 AM. Разбавьте исходный раствор до соответствующего объема cRPMI и концентрации шесть микрограммов на миллилитр.
Поместите средство на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Затем используйте эту среду, чтобы разбавить предварительно приготовленную клеточную суспензию в соотношении один к одному, чтобы получить от пяти до 6 миллионов клеток на миллилитр. Затем в 12-луночную культуральную пластину добавляют один миллилитр клеточной суспензии на лунку для каждого экспериментального состояния.
Подготовьте один окрашенный контрольный образец для Indo-1, не содержащего кальция, добавив EGTA в клетки, загруженные красителем Indo-1. Подготовьте лунку для биологического отрицательного контроля без флуорофоров или красителя Indo-1. Подготовьте положительный контроль Indo-1, добавив иономицин в концентрации 50 микромоль к нагруженной красителем клеточной суспензии на проточном цитометре.
Кроме того, подготовьте лунку для контроля одиночного окрашивания для дополнительных клеточных популяций с использованием флуорофоров, конъюгированных антителами. Затем добавьте два микрограмма антитела, блокирующего рецептор FC, на миллион клеток и инкубируйте планшет в течение 45 минут с постукиванием каждые 15 минут, чтобы ресуспендировать клетки. После инкубации перемешайте и извлеките из пластины весь объем клеток и добавьте его в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 миллилитра.
Центрифугу и сцедить надосадочную жидкость. После того, как клетки будут промыты одним миллилитром предварительно подогретого cRPMI, снова гранулируйте и сцедите надосадочную жидкость. Ресуспендируют клетки в одном миллилитре cRPMI и инкубируют каждую пробирку, оставляя верхнюю часть пробирки слегка открытой для газообмена, что позволяет полностью деэтерификовать внутриклеточные эфиры AM.
Затем приготовьте основную смесь всех определенных пользователем конъюгированных антител флуорохрома и добавьте ее к покоящимся клеткам для получения одного миллилитра объема клетки. После отдыха гранулируйте ячейки и промойте гранулы, ресуспендируя в одном миллилитре cRPMI, охлажденном до четырех градусов Цельсия. Повторите этот шаг и поместите трубочки на лед.
Ресуспендирование отдельных образцов в 500 микролитрах cRPMI без фенола с использованием пятимиллилитровой полистирольной проточной трубки с крышкой. Чтобы поддерживать температуру с помощью анализа кальциевого флюса, приготовьте ванну с шариками, добавив шарики для ванны на небольшую водяную баню и нагрейте ее до 37 градусов по Цельсию. Аккуратно разрежьте 50-миллилитровую хроническую трубку пополам и выбросьте верхнюю часть тюбика.
Заполните три четверти оставшейся трубки шариками для ванны и дайте ей нагреться до 37 градусов по Цельсию в ванне с шариками. Поместите ванну с шариками рядом с проточным цитометром вместе со стойкой из пенополистирола, чтобы расположить пробирку. Перед анализом на проточном цитометре прогрейте пробирки по отдельности до 37 градусов Цельсия в течение семи минут.
Войдите в программное обеспечение проточного цитометра и перейдите на вкладку «Библиотека». Затем выберите флуоресцентные метки, чтобы добавить связанный с кальцием Индо-1 и безкальциевый Индо-1. Затем выберите УФ-лазер в группах флуоресцентных меток и нажмите «Добавить», чтобы добавить имя флуоресцентной метки.
Выберите длину волны лазерного возбуждения и излучения и нажмите кнопку Сохранить. Перейдите к экспериментальной установке. Перейдите на вкладку «Приобретение», «Открыть/Создать новый эксперимент» и добавьте в эксперимент нужные флуоресцентные метки.
Создайте опорную группу и новую группу образцов для эксперимента и пометьте обе группы. На вкладке «Приобретения» установите для записи событий максимум 10 миллионов, громкость остановки — максимальный объем в 3000 микролитров, а время остановки — максимум в 36 000 секунд. Приобретите одиночные окрашенные контрольные элементы для определяемых пользователем конъюгированных антител, включенных в многоцветную панель, и для функционального красителя Indo-1.
Добавьте 50 микромолей иономицина к связанному с кальцием положительному контролю Indo-1 и вихревому. Добавьте проточную трубку на плату для впрыска образца и нажмите кнопку «Запись». Затем добавьте отрицательный контроль Indo-1 без кальция в проточный цитометр и нажмите «Запись».
Размешайте одиночные окрашенные элементы управления, нажав кнопку «Размешать». После завершения смешивания создайте последовательные графики, используя несмешанный рабочий лист, например SSC-A против FSC-A, для удаления мусора из образца и SSC-A против SSC-H для удаления дублетов. Затем создайте ворота, нажав на Участок.
Добавьте график на рабочий лист и дважды щелкните внутри ворот, чтобы создать закрытое население, расположенное ниже по течению. Продолжайте до тех пор, пока не будут учтены все интересующие группы населения. Затем нагрейте предварительно подготовленные единичные окрашенные контрольные образцы до 37 градусов Цельсия для последовательного анализа.
Настройте программное обеспечение для проточной цитометрии и запустите DI в ледяной воде в течение двух-трех минут, чтобы обеспечить жидкостную стабильность проточного цитометра. Настройте последовательные графики на несмешанном листе, создав ворота с помощью кнопок многоугольного прямоугольника или эллипса, чтобы включить интересующую совокупность. Дважды щелкните внутри ворот и измените параметры по осям y и x на SSC-A или SSC-H.
Завершите определение параметров оси, щелкнув левой кнопкой мыши по оси. Создайте график с сигналом SSC-A в зависимости от жизнеспособности красителя. Ворота живых клеток, которые отрицательны для окрашивания аминовым красителем.
Живые клетки, отрицательные для окрашивания живых мертвецов, будут группироваться на нулевой отметке как по оси y, так и по оси x. Дважды щелкните внутренний график, чтобы создать новый график, содержащий только одноклеточные живые лимфоциты. Измените ось Y на Indo-1 в зависимости от времени на оси X для визуализации притока кальция.
Затем поместите подогретый биологический образец в SIT машины. Запускайте образцы со скоростью от 2 500 до 3000 событий в секунду при средней скорости потока, чтобы визуализировать приток кальция в ограниченном количестве клеточных популяций. Добавьте следующую трубку в ванну с шариком в контроле сбора.
Нажмите «Запись», чтобы записать исходные данные в течение 30 секунд, чтобы получить базальный уровень передачи сигналов кальция в образце. Затем нажмите «Стоп» и извлеките пробирку из отверстия для впрыска образца. Добавьте 30 мкг неконъюгированного анти-CD3 непосредственно в пробирку с образцом, чтобы инициировать приток кальция.
Быстро поместите пробирку обратно в порт для впрыска образца и нажмите «Запись» в программном обеспечении. Записывайте данные в течение семи минут, наблюдая за временем, прошедшим под контролем сбора данных в программном обеспечении. Затем нажмите «Стоп» в программном обеспечении.
Добавьте один микрограмм на миллилитр иономицина и записывайте в течение 30 секунд, чтобы получить максимальный сигнал кальция в интересующих клетках. Перейдите к следующему образцу и повторяйте рабочий процесс, пока не будут собраны все образцы. Сохраните эксперимент и нажмите на экспортный zip-файл.
Несмешанные файлы загружаются во внешнее программное обеспечение для анализа проточной цитометрии. Стабильный последовательный сигнал на графике зависимости времени от бокового рассеяния указывал на флюидную стабильность. Популяция лимфоцитов была закрыта с последующим различением синглетов на графике высоты бокового разброса по сравнению с площадью.
Синглеты оценивали на жизнеспособность. Затем был применен стробирование на CD19-отрицательной популяции. Эти подмножества Т-клеток оценивали с использованием антител к CD4 и CD8 путем визуализации связанной с кальцием флуоресценции Indo-1 в зависимости от времени.
В отдельных клеточных популяциях график зависимости связанного с кальцием Indo-1 от времени показал исходный уровень до стимуляции. Пиковая реакция по мере снижения внутриклеточного уровня кальция и кальциевого ответа, вызванного добавлением иономицина. До добавления антител против CD3 был обнаружен слабый сигнал Indo-1, связанный с кальцием.
Во время пикового ответа клетки показали сильный сигнал Индо-1, связанный с кальцием, и уменьшили количество свободного от кальция Индо-1. Через пять минут после пика флуоресценция Indo-1 почти вернулась к исходному уровню. После добавления иономицина был визуализирован надежный сигнал связанного с кальцием Indo-1, что указывает на адекватную загрузку красителя в клетках.
Анализ редких популяций проводился путем построения графика связи между кальцием Indo-1 и Indo-1 без кальция после стробирования каждой интересующей популяции. И анализ реакции кальция на протяжении всего периода времени для каждого подмножества. Кальциевый поток с использованием профилирования полного спектра может привести к высокопараметрическому проточному цитометрическому анализу в различных иммунных подмножествах.
Высокоразмерный анализ для несмещенной кластеризации подмножеств Т-клеток может быть использован в сочетании с высокопараметрической проточной цитометрией для расширенного анализа. Этот метод разработан для анализа нескольких иммунных подмножеств в сочетании друг с другом в объемном образце.
