Изучение биоэнергетических профилей оксфоса и гликолиза в режиме реального времени становится ключевым фактором в характеристике здоровья и функции RPE. Респирометрия высокого разрешения позволяет эффективно сравнивать метаболический статус нормального и больного РПЭ. Преимущество этого метода заключается в одновременном исследовании как оксфоса, так и гликолиза путем измерения скорости потребления кислорода, OCR и скорости внеклеточного подкисления, ECAR.
Клетки RPE являются высокометаболически активными клетками и являются одними из первых клеток, которые дегенерируют во время ВМД. Понимание их метаболической и митохондриальной функции позволяет разрабатывать новые лекарства. Для начала добавьте 100 микролитров на лунку клеточной суспензии в среде RPE человека до конечной концентрации 20 000 клеток на 100 микролитров в каждой лунке.
И убедитесь, что четыре угловых колодца пусты. Пипетка поднимается и опускается несколько раз, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию, используя многоканальную пипетку для простоты и согласованности. Добавьте 100 микролитров носителя только в четыре пустые угловые лунки для коррекции фона.
Оставьте планшет для культивирования клеток при комнатной температуре на один час, чтобы свести к минимуму эффект краев. Затем помещают его в инкубатор с 5%-ным углекислым газом 37 градусов по Цельсию и увлажняют. После ночной инкубации исследуйте клетки под микроскопом, чтобы проверить их морфологию и уровень пигментации перед сменой среды.
В последующие дни обследования убедитесь, что клетки сливаются с характерной морфологией, похожей на булыжник, и со временем приобретают пигментацию. Чтобы обеспечить гидратацию картриджа датчика за день до анализа, заполните каждую скважину технической пластины 200 микролитрами деионизированной воды и поместите картридж датчика, погруженный в воду, на полезную пластину. Храните примерно 20 миллилитров раствора калибранта в течение ночи в увлажненной духовке при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа.
Включите прибор для респирометрии с высоким разрешением и запустите программное обеспечение, чтобы прибор стабилизировался при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи. В день проведения анализа замените воду в служебной пластине равным объемом подогретого раствора калибранта не менее чем за 45 минут до проведения анализа. Нагрейте 25 миллилитров подготовленной среды для стресс-теста Mito без фенольного красного до 37 градусов Цельсия и вакуумный фильтр фильтрующего материала с температурой pH 7,4 с помощью фильтрующего блока с трубчатой крышкой.
Удалите среду RPE человека из планшета для клеточных культур и добавьте 100 микролитров свежеприготовленной пробирной среды. Затем поместите тарелку для клеточных культур в увлажненную печь с температурой 37 градусов Цельсия без углекислого газа на один час перед началом анализа. Каждый сенсорный картридж имеет четыре порта подачи реагентов на лунку для впрыска исследуемых соединений в пластинчатые лунки для клеточных культур во время анализа.
Приготовьте по три миллилитра растворов препарата Tenex каждый, разбавив запасы лекарств в соответствующих анализовых средах. Затем пипеткой вводят 20 микролитров лекарственного препарата «Техснабэкспорт» в порт А, 22 микролитра в порт Б и 25 микролитров в порт С для достижения заданной конечной концентрации лекарственного средства в каждой лунке. Затем в программном обеспечении для анализа откройте вкладку шаблонов, выберите стресс-тест Mito и заполните определения групп.
Введите подробную информацию о стратегии инъекций препаратов стресс-теста Mito. Затем введите подробную информацию о различных экспериментальных группах в анализе для контроля или лечения. Ввод сведений об анализируемой среде для добавления различных добавок и их конкретных концентраций в базовую анализирующую среду.
И, наконец, добавьте тип ячейки. Нажмите на следующую вкладку, а затем на карту плит, чтобы назначить различные исследуемые группы в их конкретное местоположение на 96-скважинной плите. После заполнения карты пластин щелкните вкладку протокола, чтобы просмотреть протокол прибора для протокола стресс-теста Mito по умолчанию.
Затем нажмите «Запустить анализ» и вставьте картридж датчика, погруженный в раствор калибра, в полезную пластину для калибровки. Этот процесс занимает около 25 минут, и каждый биосенсор калибруется независимо на выходе датчика, измеренном в растворе калибранта с известной концентрацией pH и кислорода. По завершении калибровки снимите полезную пластину и вставьте пластину для культивирования клеток.
После базового измерения прибор автоматически впрыскивает лекарственный раствор порта А в каждую лунку, которая следует за тремя циклами смешивания и измерения по три минуты каждый. Такая же картина происходит после каждой последующей инъекции препарата в другие порты. После завершения прогона извлеките пластину для культивирования клеток и картридж датчика.
В целях контроля качества убедитесь, что все порты для лекарств и картридж датчика были введены, проверив порты на отсутствие остатков лекарства. Затем исследуйте клетки в микропланшете клеточной культуры под микроскопом, чтобы убедиться в сливающемся монослое клеток. Затем откажитесь от пробирной среды и замените ее 60 микролитрами одного буфера для лизиса в каждой лунке.
Оберните края пластины парапленкой, чтобы предотвратить испарение, и поместите ее в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию, чтобы облегчить лизис клеток в течение ночи перед количественной оценкой содержания белка с помощью анализа BCA. Согласно анализу данных, нормализуйте все данные, разделив скорость потребления кислорода или OCR и скорость внеклеточного подкисления или значения ECAR на микрограммы белка в каждой лунке. Затем экспортируйте генератор отчетов о стресс-тестах Mito, который использует макросы Excel для автоматического расчета параметров стресс-теста Mito с помощью программного обеспечения для анализа данных.
Следуя тем же шагам, которые были продемонстрированы для стресс-теста Мито, можно провести гликолитический стресс-тест, за исключением добавок для анализируемых сред и инъекций лекарств, которые отличаются, как показано в таблице один и таблица два. Прибор одновременно измеряет как OCR, так и ECAR для каждого пробега. Для стресс-теста Mito расчеты периметра основаны на показаниях OCAR, тогда как для гликолитического стресс-теста расчеты параметров основаны на показаниях ECAR.
Вот кривая OCR, полученная при выполнении стресс-теста Mito на первичных клетках RPE человека. Расчеты параметров стресс-теста Mito отображаются в виде гистограмм. Точно так же это кривая ECAR, полученная в результате выполнения гликолитического стресс-теста на первичных клетках RPE человека, и расчеты показаны в виде гистограмм.
Чтобы оптимизировать инъекцию препарата порта B для стресс-теста Mito, сравнивали эффективность двух разъединяющих агентов в увеличении OCR в первичных клетках RPE человека. Было обнаружено, что BAM15 превосходит FCCP в повышении дыхательной способности митохондрий, о чем свидетельствует значительно более высокое максимальное дыхание и резервная дыхательная способность с BAM15 по сравнению с FCCP. Важно не забывать увлажнять картридж датчика за день до проведения анализа.
Этот метод позволяет исследователям лучше охарактеризовать биоэнергетические профили клеток RPE и понять, как клетки RPE проявляют метаболическую гибкость в ответ на различные патогенные стимулы.
