Работа в лаборатории автора финансируется Канадским институтом исследований в области здравоохранения, Канада Фонд инноваций, естественным наукам и инженерным исследованиям Совета и Университет Конкордия.

Строительство диплоидных штаммов Протокол для производства диплоиды в результате скрещивания <ol><li> Начальная штаммы должны быть исключены на YPD или селективной среде, в случае необходимости, для получения отдельных колоний. Два гаплоидных штаммов должны быть противоположного типа спаривания (т.е. Мата и MATα). </li><li> Использование стерильной петлей прививки выбрать небольшую часть колонии с одного из двух гаплоидных штаммов. На новом YPD полоса пластины цикла раз в прямой линией, пересекающей пластине. Марк направление штрих, с стрелку на нижней пластине. </li><li> Повторите эту процедуру для второго нагрузку на YPD же пластины. На этот раз полоса колонии перпендикулярно к первой, пересекая первую полосу со второй. Марк направление второй полосе и обратите внимание на область, где вторая полоса пересекает первую очередь. Эта область будет где диплоиды будет производиться. </li><li> Инкубируйте YPD пластины при температуре 30 ° С в течение ночи. </li><li> Реплика пластины YPD пластины на селективных средах, что будет выборочно разрешать рост новообразованных диплоиды. </li><li> Выберите одну колонию, если это возможно, или небольшая часть полосы диплоидных и полосы на тот же селективной среды для получения отдельных колоний. </li></ol> Плодоношение и пищеварение асков Протокол <ol><li> Выберите одну из колоний пластины выше и делать небольшие (1см х 1см) пятна на споруляции (SPO) пластин и инкубировать при 30 ° С в течение 3-7 дней, чтобы sporulate. </li><li> Плодоношение можно проверить, посмотрев на клетки от каждого патча под световым микроскопом. Место клетки на предметном стекле микроскопа в 5-10 мкл воды, место покровное в верхней части капли, и посмотреть на наличие сумки. Если сумки не легко найти то положил обратно в инкубатор. </li><li> Если есть эффективные споруляции в одном из патчей, готовят стерильные 15 мл коническую трубку с 100 мкл сок тетрады. </li><li> Выберите клетки по сравнению с этим споруляции патч с стерильные 3 мм петля прививки (клетки должны охватывать четверть цикла) и место в соке тетрады. Аккуратно водоворот цикл, чтобы клетки падать петля и смешать с раствором. </li><li> Оставить в тетрады сок (содержащий zymolyase) для 4-10 минут (в зависимости от концентрации и активности zymolyase и деформаций себя). Это позволяет для переваривания клеточной стенки окружающего аскоспор. </li><li> Марк верхней и нижней части посевного области на YPD пластины. </li><li> Необязательно. Реакция может быть остановлено путем добавления 1 мл ледяной стерильной дН 2 O. Разрешить клетки согласиться на 5 мин. Удалить из 1 мл надосадочной затем смешайте слегка рукой и держать на льду. </li><li> Возьмите 5 мкл переваренной клетки с шага 5, нежно кладем капель в строке в посевной области заранее заполненных YPD пластины. </li><li> Используйте стерильные 3 мм петля прививка очень мягко распространению капель 1-3 раза в линии, а едва контакт с агара. </li><li> Дайте жидкости впитаться в агар (шаг 7 Если не указано, это когда переваривание внешней клеточной стенки будут сокращены или остановка). Приступить к рассечение микроскопом. </li></ol> Препарирование Аски Протокол Обратите внимание, что следующий протокол описан для системы Певица MSM 200 микроманипуляция микроскопом. Этот протокол может следовать с небольшими изменениями, если используется ручной микроманипулятора, таких как микроманипулятора Zeiss MR. <ol><li> Сосредоточьтесь на области пластины, где половина поле содержит клетки и половину пуст. Медленно иглы в центр внимания, что она касается пустой области поля. Это гарантирует, что игла не содержат клетки от предыдущего использования. Контакт между иглой и агар рассматривается как темный черный круг, который медленно вступает в фокусе. </li><li> К матрице на позиции А1 и сделать отметку, прокалывая агар снова. Это поможет определить ориентацию пластины, если она снимается микроскопом до завершения. </li><li> Переключение в режим поиска. Найдите сумки. Предпочтительно выбирать сумки, которые находятся в районах, где клетки хорошо распространено. Избегайте мест с клеточными кластерами. Четыре аскоспор из сумки все равно должны быть привязаны друг к другу. Два аскоспор может быть немного больше, чем два других. Избегайте выбора сумки, где один аскоспор является свободным и не связан с остальными аскоспор. </li><li> Возьмите сумке с иглой. Медленно иглы до пластины. Когда тени микроиглы видно, линии это с сумке, чтобы ее взяли. Снова подход иглы, пока черный контур круга (кончик иглы) не наблюдается. Сенсорный тетрады с этим кругом, а затем быстро вытащить иглу прочь. Убедитесь, что все четыре аскоспор от аск присоединившимся к игле и что никакие дополнительные ячейки были собраны на микроиглы, которые не являются частью этой сумке. </li><li> Вытяните микроиглы далеко от плиты и перейти к матрице (для первого сумке, перейдите кпозиция А1). Обратите внимание на каждую позицию, где аск перемещается. Место аск вниз, касаясь пластины с микроиглы и трогания с места, пока все четыре аскоспор оторваться микроиглы. Нежный прослушивание руки иглу или платформы холдинга YPD пластины часто бывает полезно на этом шаге. </li><li> Повторите шаги 3-5 и место сумки вниз на последовательных позиций на матрице до желаемого количества сумки были собраны. </li><li> Вернитесь к каждой сумке и сломать четыре клетки на части дразня с иглой, постукивая платформы мягко или комбинация обоих. Возьмите клетки, оставляя одну позади на новую позицию в матрице, пока каждый аскоспор В каждой сумке разделен на строки из четырех человек. </li><li> Место YPD пластины в инкубаторе при температуре 30 ° С в течение нескольких дней наблюдать модель роста. </li><li> Реплика пластины расчлененные клеткам селективные среды, если это необходимо. </li></ol> Перемещение Зиготы Протокол <ol><li> Подряд два гаплоидных штаммов с противоположных типов спаривания на соответствующую среду для получения отдельных колоний. </li><li> Мать этих двух штаммов, как описано выше, и позволяют выращивать в возрасте от 4 до 6 часов (или на ночь, если это необходимо). </li><li> Проверьте зиготы под световым микроскопом. Зиготы появится как гантели клетки с помощью или без почки. </li><li> Выберите клетки с 3 мм петля прививки (клетки должны охватывать четверть цикла) и место мягко 100 мкл стерильной дН 2 O. </li><li> Марк верхней и нижней части посевного области на YPD пластины. </li><li> Возьмите 5 мкл, нежно кладем капель в строке в посевной области заранее заполненных YPD пластины. </li><li> Используйте 3 мм петля прививки распространяться капель в линию очень мягко в то время как едва контакт с агара. </li><li> Дайте жидкости впитаться в агар. Приступить к рассечение микроскопом. </li><li> Сосредоточьтесь на области пластины, где половина поле содержит клетки и половину пуст. Медленно иглы в центр внимания, что она касается пустой области поля. Это гарантирует, что игла не содержат клетки от предыдущего использования. Контакт между иглой и агар рассматривается как темный черный круг, который медленно вступает в фокусе. </li><li> К матрице на позиции А1 и сделать отметку, прокалывая агар снова. Это поможет определить ориентацию пластины, если она снимается микроскопом до завершения. </li><li> Переключение в режим поиска. Найдите зиготы. </li><li> Возьмите зиготы с иглой. </li><li> Место зиготы индивидуально на матрицу. </li><li> Разрешить зиготы расти в течение нескольких дней. </li><li> Реплика пластины зиготы на соответствующей селективной среде. </li></ol> Представитель Результаты <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Рисунок 1: спаривание двух гаплоидных штаммов противоположных типов спаривания генерирует диплоидного штамма. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Рисунок 2: () YPD пластины с Автошоу результаты спаривания между температурой чувствительного штамма (с leu2 auxotrophy) и дикого типа (LEU2). Дайджестом клетки распространяются в регионе посевной слева, где толстые роста между двумя черными линиями видел. Сумки, которые были расчлененные расти равномерно распределенных в матрице справа. (B) пластина в (А) была воспроизведена на SD-лейцин, бросающих пластины. Обратите внимание, 2:02 роста LEU2 маркер, указывающий проверки аскоспор был расчленены. (C) пластина в (А) была воспроизведена на YPD пластины и инкубировали при 37 ° C. Обратите внимание, 2:02, что дальнейший рост подтверждает, что аскоспор были расчленены.

<ol>
	<li>Sherman, F., Hicks, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+and+Dissection+of+Asci.">Micromanipulation and Dissection of Asci.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 21-37 (1991).</li></ol>

Авторы не имеют ничего разглашать.

Дрожжи вскрытия является полезным инструментом для выбора новых штаммов с нужными маркерами. При определении теоретической модели роста из четырех аскоспор важно, чтобы смотреть на генотип вегетативные клетки. Если плазмиды присутствует, надо знать, если она не замужем, низкая или вы?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Singer MSM System 200</td>
<td>Microscope</td>
<td>Singer Instruments</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-sorbitol</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOR508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zymolyase 100T</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seikagaku Corporation</td>
<td>120493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YEX401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PEP 403</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YNB406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bio-tryptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOD002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium acetate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>POA 301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>AGR003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ADS201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-uracil</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>URA 241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>HIS 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-arginine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Amresco</td>
<td>0877-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-methionine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>MET 222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tyrosine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TYR 333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ISO 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-valine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>VAL 201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LYS 101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-phenylalanine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PHA 302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU 202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-threonine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>THR002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LEU 222</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of saccharomyces cerevisiae asci

Дрожжи очень послушный модель системы, которая используется для изучения различных клеточных процессов. Общая нагрузка лаборатории<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em&gt; Существует в любом гаплоидных или диплоидных государства. Способность сочетать аллелей от двух гаплоидов и способности вносить изменения в геноме требует производства и вскрытия сумки. Сумки продукции из гаплоидных клеток начинается с спаривания двух гаплоидных дрожжевых штаммов с совместимых типов спаривания, чтобы произвести диплоидные напряжения. Это может быть достигнуто в несколько способов как на твердой среде или в жидкости. Это выгодно, чтобы выбрать для диплоиды в среду, избирательно способствует их росту по сравнению с любым из гаплоидных штаммов. Диплоиды затем разрешили sporulate на бедных питательными веществами средой для формирования сумки, пакет из четырех гаплоидных дочерних клеток в результате мейоза воспроизводства диплоидные. Смесь растительных клеток и сумки затем обрабатывают ферментом zymolyase переварить от мембранного мешка окружающих аскоспор из сумки. Использование микроманипуляция с микроиглы под микроскопом рассечение можно подобрать индивидуальный сумки и отдельно и перемещать четыре ascopores. Расчлененный сумки выращивается в течение нескольких дней и испытаны для маркеров или аллелей интерес при посеве реплики на соответствующих селективных средах.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci at JoVE.com

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Микроманипуляция дрожжевых клеток необходимо для мейоза генетического анализа или для выбора диплоидные зиготы. Эти micromanipulations осуществляются с помощью микроиглы о вскрытии микроскопом. Микроиглы используется для перемещения клетки и находится под контролем микроманипулятора, которые доступны с различной степенью автоматизации.

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

18.4K Views.  Concordia University. Микроманипуляция дрожжевых клеток необходимо для мейоза генетического анализа или для выбора диплоидные зиготы. Эти micromanipulations осуществляются с помощью микроиглы о вскрытии микроскопом. Микроиглы используется для перемещения клетки и находится под контрол...

Video: Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка выражается в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

ЭПР Контролируемый окислительно-восстановительного титрования из кофакторами<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Измерение мРНК темпы разложения в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Использование<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Штаммы

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Направленный метод Эволюция<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em&gt;: Mutant Создание и скрининг библиотеки

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...