Этот протокол включает в себя тестирование антибактериальной эффективности антибиотиков, элюированных из полимерного устройства, в режиме реального времени, что может помочь в точном определении эффективных составов, повышающих их трансляционную ценность. Этот метод позволяет в режиме реального времени тестировать антибактериальную эффективность для мониторинга продольной активности материалов с лекарственным покрытием и понимать диапазон антибактериальной активности для данной формы имплантата. Этот полимерный материал используется более чем в 90% от общего числа замен соединений в качестве опорной поверхности.
И эти его составы с антибиотическим покрытием разработаны в качестве возможных методов лечения перипротезных инфекций суставов. Этот способ может быть использован с любым устройством для нанесения лекарственного покрытия, таким как пористые металлы, разлагаемые и неразлагаемые полимеры, гели и, возможно, твердые частицы с модификациями протокола, специфичными для материала. Для начала культивируйте бактерии на ночь в одном миллилитре триптического соевого бульона.
Затем разведите выращенную в течение ночи бактериальную суспензию в стерильном бульоне Мюллера Хинтона, или MHB, и проверьте жизнеспособное количество бактерий с помощью единиц люминесценции до начала эксперимента, как описано в рукописи. Поместите полоски СВМПЭ с первичным и лекарственным средством в трехмиллилитровый шприц. Затем наберите MHB-содержащую бактериальную суспензию в шприц через прикрепленную иглу до отметки 1,5 миллилитра.
Поместите набор шприцев в встряхивающий инкубатор до указанных временных отметок в шесть часов, а затем каждый день до седьмого дня. После каждого указанного момента времени вынимайте набор шприцев и выливайте носитель в двухмиллилитровую пробирку. Проведите анализ микробной жизнеспособности в режиме реального времени, как описано в рукописи, используя 100 микролитров бактериальной суспензии.
После определения количества жизнеспособных бактерий рассчитайте колониеобразующие единицы на миллилитр из единиц люминесценции, используя соответствующую стандартную кривую. Чтобы убедиться в отсутствии жизнеспособных бактерий в образцах, которые показали значения люминесценции ниже предела обнаружения, распределите культуру на триптических пластинах с соевым агаром. Инкубируйте тарелки при температуре 35 градусов Цельсия в течение ночи.
Затем проверьте наличие колоний на следующий день. Центрифугируйте оставшуюся бактериальную суспензию. Аккуратно аспирируйте отработанные носители.
Оставьте 100 микролитров надосадочной жидкости в пробирках с невидимыми гранулами. Ресуспендировать гранулированные бактерии в свежем MHB. Вихревите в течение 10 секунд, чтобы обеспечить полную ресуспендирование.
Затем наберите бактериальную суспензию в тот же шприц через прикрепленную иглу. Начните с извлечения первичных и нагруженных лекарством поверхностей СВМПЭ из установки шприца после завершения исследования на седьмой день. Затем переложите поверхности в 1,5-миллилитровые пробирки и трижды промойте одним миллилитром стерильного PBS.
Обработайте поверхность ультразвуком в течение 40 минут в одном миллилитре стерильного PBS. Определите жизнеспособность адгезивных бактерий, выполнив люминесцирующий анализ на 100 микролитрах образца, обработанного ультразвуком. Высвобождение лекарственного средства из ванкомицина и гентамицина, нагруженного СВМПЭ, продемонстрировало взрывное высвобождение через шесть часов с последующей устойчивой скоростью высвобождения с концентрацией, превышающей минимальную ингибирующую концентрацию, до семи дней.
СВМПЭ с ванкомицином и гентамицином продемонстрировал снижение восприимчивости ATCC 12600 более чем на три log, начиная с шести часов, а полная эрадикация наблюдалась на третий день. Для чувствительного к гентамицину и промежуточного штамма ванкомицина, L1163, оба материала с лекарственным покрытием вызывали снижение более чем на три log в течение шести часов, и в первый день роста колоний не наблюдалось. Элюирование гентамицина из СВМПЭ не влияло на бактериальную жизнеспособность гентамицин-резистентного и ванкомицин-промежуточного штамма L1101.
Напротив, элюирование ванкомицина из СВМПЭ значительно снижало жизнеспособность бактерий через шесть часов. Поверхности как гентамицина, так и СВМПЭ с ванкомицинным покрытием не показали жизнеспособных адгезивных бактерий при воздействии восприимчивых и промежуточных штаммов резистентности после седьмого дня. Тем не менее, некоторые жизнеспособные бактерии присутствовали на СВМПЭ с гентамицинным покрытием, подвергшихся воздействию резистентного к гентамицину L1101.
Поверхность контрольного первичного полиэтилена показала жизнеспособные адгезивные бактерии при воздействии каждого штамма. Разделение отработанных сред в каждый момент времени, облегчающее перенос микробной популяции, имеет решающее значение для моделирования длительного воздействия антибиотиков. Несмотря на то, что этот метод полустатического моделирования является усовершенствованием статических методов, за ним может последовать непрерывная установка для дальнейшего понимания кинетики активности новых лекарственных препаратов против инфекций.
Протокол позволил нам зафиксировать влияние элюирования лекарственного средства на штаммозависимую бактериальную динамику. Это расширяет инструменты для оценки эффективности устройств устойчивой доставки антибиотиков.
