Esse protocolo envolve o teste da eficácia antibacteriana em tempo real de antibióticos eluídos de um dispositivo polimérico, o que pode ajudar a determinar com precisão formulações eficazes, aumentando seu valor translacional. Esse método permite testar a eficácia antibacteriana em tempo real para monitorar a atividade longitudinal de materiais farmacológicos e entender a gama de atividade antibacteriana para uma determinada formulação de implante. Este material polimérico é usado em mais de 90% das substituições totais de articulações como superfície de rolamento.
E essas formulações farmacológicas são desenvolvidas como possíveis tratamentos para infecções articulares periprotéticas. Esse método pode ser utilizado com qualquer dispositivo farmacológico, como metais porosos, polímeros degradáveis e não degradáveis, géis e, possivelmente, materiais particulados com modificações de protocolo específicas do material. Para começar, cultive as bactérias durante a noite em um mililitro de caldo de soja tríptico.
Em seguida, diluir a suspensão bacteriana cultivada durante a noite em caldo estéril Mueller Hinton, ou MHB, e verificar a contagem bacteriana viável usando as unidades de luminescência antes do início do experimento, conforme descrito no manuscrito. Coloque as tiras UHMWPE virgens e carregadas com drogas dentro de uma seringa de três mililitros. Em seguida, desenhe a suspensão bacteriana contendo MHB na seringa através da agulha conectada até a marca de 1,5 mililitro.
Coloque a seringa em uma incubadora de agitação até o tempo indicado de seis horas e, em seguida, todos os dias até o sétimo dia. Após cada ponto de tempo indicado, retire a configuração da seringa e distribua o meio em um tubo de dois mililitros. Realizar um ensaio de viabilidade microbiana em tempo real, conforme descrito no manuscrito, utilizando 100 microlitros de suspensão bacteriana.
Depois de determinar a contagem de bactérias viáveis, calcule as unidades formadoras de colônias por mililitro a partir das unidades de luminescência usando a curva padrão correspondente. Para verificar a ausência de bactérias viáveis nas amostras que apresentaram valores de luminescência abaixo do limite de detecção, difundiu a cultura em placas de ágar tríptico de soja. Incube as placas a 35 graus Celsius durante a noite.
Em seguida, verifique a presença de colônias no dia seguinte. Centrifugar a suspensão bacteriana restante. Aspirar suavemente o meio gasto.
Deixe 100 microlitros de sobrenadante nos tubos com pellets invisíveis. Ressuspender as bactérias peletizadas em MHB fresco. Vórtice por 10 segundos para garantir a reuspensão completa.
Em seguida, desenhe a suspensão bacteriana na mesma configuração da seringa através da agulha acoplada. Comece recuperando superfícies UHMWPE virgens e carregadas com medicamentos da configuração da seringa após a conclusão do estudo no sétimo dia. Em seguida, transfira as superfícies para tubos de 1,5 mililitro e enxágue com um mililitro de PBS estéril três vezes.
Sonicar a superfície por 40 minutos em um mililitro de PBS estéril. Determinar a viabilidade de bactérias aderentes realizando um ensaio de luminescência em 100 microlitros da amostra sonicada. A liberação do fármaco a partir de vancomicina e UHMWPE carregado de gentamicina demonstrou uma liberação de explosão em seis horas, seguida por uma taxa de liberação constante com uma concentração maior do que a concentração inibitória mínima até sete dias.
UHMWPE com vancomicina e gentamicina demonstrou redução de mais de três log para ATCC 12600 suscetível a partir de seis horas e erradicação completa foi observada no terceiro dia. Para a cepa L1163 suscetível à gentamicina e intermediária à vancomicina, ambos os materiais eluidores causaram redução de mais de três log em seis horas e nenhum crescimento de colônia foi observado no primeiro dia. A eluição de gentamicina a partir de UHMWPE não afetou a viabilidade bacteriana da cepa L1101 L1101 resistente à gentamicina e vancomicina.
Pelo contrário, a eluição de vancomicina a partir de UHMWPE reduziu significativamente a viabilidade bacteriana em seis horas. As superfícies de ambos, gentamicina e UHMWPE eluidores de vancomicina não mostraram bactérias aderentes viáveis quando expostas a cepas suscetíveis e de resistência intermediária após o sétimo dia. No entanto, algumas bactérias viáveis estavam presentes em UHMWPE eluidores de gentamicina expostos a L1101 resistente à gentamicina.
A superfície controle do polietileno virgem apresentou bactérias aderentes viáveis quando expostas a cada cepa. A separação dos meios gastos em cada ponto de tempo, facilitando o transporte da população microbiana, é crucial para simular a exposição sustentada aos antibióticos. Embora seja uma melhoria nos métodos estáticos, este método de simulação semi-estática pode ser seguido com uma configuração contínua para entender melhor a cinética de atividade de novas formulações de drogas contra infecções.
O protocolo permitiu captar o efeito da eluição de fármacos na dinâmica bacteriana cepa-dependente. Ele aprimora as ferramentas para a avaliação da eficácia de dispositivos de administração sustentada de antibióticos.
