Описанный здесь протокол представляет собой интегративный метод, сочетающий классические микробиологические анализы с одноклеточной визуализацией в реальном времени для характеристики персистирующих клеток Escherichia coli после лечения высоким содержанием офлоксацина. Основным преимуществом данной методики является анализ явления персистенции на популяционном и одноклеточном уровне. Сочетание популяционного и одноклеточного анализа позволяет молекулярной и клеточной характеристике фенотипа персистенции.
Для начала выделите интересующий бактериальный штамм из замороженного глицеринового бульона на агаровой пластине LB и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи в течение 15-19 часов, чтобы получить отдельные колонии. Инокулируют изолированную колонию в стеклянную пробирку, содержащую пять миллилитров питательной среды MOPS, дополненной 0,4% глюкозой, и, при необходимости, добавляют в среду селективный антибиотик. Поместите пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 180 об/мин на ночь.
На следующий день центрифугируйте один миллилитр культуры в 2 300 г в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки, и осторожно ресуспендируйте гранулу с тем же объемом PBS. Измерьте OD в 600 нанометрах и рассчитайте объем, необходимый для начального OD600 0,01 в конечном объеме в два миллилитра. Затем добавьте два миллилитра глицерина MOPS 0,4% в лунку с прозрачным дном, 24-луночную пластину и инокулируйте рассчитанным объемом культуры за ночь.
Поместите 24-луночную пластину в автоматический считыватель микропланшетов, чтобы контролировать OD600 в течение 24 часов. Настройте считыватель микропланшетов на измерение OD600 каждые 15 минут при температуре 37 градусов по Цельсию и с высоким вращением орбиты 140 об / мин. Растопите 100 миллилитров агара LB и храните колбу при температуре 55 градусов по Цельсию, чтобы избежать затвердевания.
Подготовьте шесть маленьких стеклянных колб и налейте в каждую колбу пять миллилитров жидкой агаровой среды LB с помощью стерильной пипетки. Возьмите 10 микролитров из пяти миллиграммов на миллилитр исходного раствора офлоксацина и разведите в 90 микролитрах сверхчистой воды. Добавляйте увеличивающиеся объемы разбавленного офлоксацина в каждую из шести стеклянных колб, содержащих агаровую среду LB, чтобы получить конечную концентрацию от нуля до 0,1 микрограмма на миллилитр офлоксацина.
Смешайте раствор, повернув колбы несколько раз, и вылейте агаровую среду с добавлением антибиотика в шестилуночную культуральную тарелку. Дайте агару остыть до застывания и высушите тарелку перед использованием. Разбавьте бактериальную культуру на ночь до конечной плотности клеток от 10 до седьмого КОЕ на миллилитр с помощью PBS.
Нанесите два микролитра разбавленной культуры на каждую лунку высушенной шестилуночной тарелки. Дайте пятнам высохнуть, прежде чем помещать тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день проверьте, при какой концентрации офлоксацина подавляется рост колоний бактерий.
Налейте примерно 25 миллилитров приготовленного агара LB в чашку Петри. Затем добавьте пять-восемь стерильных стеклянных шариков в каждую затвердевшую и высушенную пластину. Переверните и пометьте пластины.
Затем подготовьте десятикратное последовательное разведение стеклянных пробирок, содержащих 900 микролитров 0,01-молярного раствора сульфата магния. В стеклянной пробирке разбавьте ночную культуру в свежей среде с поправкой на температуру до конечного OD600 примерно 0,001 и дайте культуре вырасти в течение ночи в инкубаторе. На следующий день, когда OD600 достигнет 0,3, перенесите 100 микролитров культуры для разведения по данным точечного анализа.
Выполняют десятикратное серийное разведение бактериальной культуры. Затем выложите 100 микролитров разведенной культуры на подготовленные агаровые пластины LB. Добавьте желаемую концентрацию офлоксацина в бактериальную культуру и продолжайте инкубацию при 37 градусах Цельсия при встряхивании.
В соответствующие моменты времени извлеките 100 микролитров культуры и разбавьте культуру в соответствии с данными точечного анализа. Планшет 100 микролитров разбавленной культуры на агаровых пластинах LB. На следующий день подсчитайте колонии ночных инкубированных пластин в двух самых высоких разведениях, для которых могут быть обнаружены колонии.
Рассчитайте коэффициент выживаемости, нормализовав КОЕ на миллилитр в каждый момент времени при КОЕ на миллилитр при T0, и построите нормализованное значение логарифмического основания 10 в зависимости от времени. Удалите консервирующий раствор из каждого отверстия микрофлюидной пластины и замените его свежей питательной средой. Запечатайте микрофлюидную пластину с помощью коллекторной системы, нажав кнопку «Уплотнение» или с помощью микрофлюидного программного обеспечения.
Затем в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения выполните первую последовательность заливки, нажав «Запустить последовательность заливки жидкости». Инкубируйте пластину в термостатическом шкафу микроскопа при температуре 37 градусов Цельсия в течение как минимум двух часов перед началом микроскопии. Затем перед началом эксперимента запустите вторую последовательность жидкостной заливки.
Запечатайте микрофлюидную пластину, нажав «Распечатать пластину» в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения. Замените среду в лунках 200 микролитрами свежей среды, содержащей антибиотик свежей средой, и 0,01 OD разбавленной образца культуры в свежей среде. После герметизации микрофлюидной пластины, как показано ранее, поместите пластину на объектив микроскопа внутри корпуса микроскопа.
В микрофлюидном программном обеспечении нажмите на последовательность загрузки ячеек, чтобы разрешить загрузку ячеек в микрофлюидную пластину. Установите оптимальный фокус с помощью режима проходящего света и выберите несколько областей интереса, где можно наблюдать соответствующее количество ячеек до 300 ячеек на поле. В микрофлюидном программном обеспечении отредактируйте Run a Custom Sequence, чтобы запрограммировать впрыск свежей среды в 6,9 килопаскаля в течение шести часов в первую и вторую лунки, затем среду, содержащую антибиотик в 6,9 килопаскаля, или шесть часов в третью лунку, и, наконец, свежую среду в 6,9 килопаскаля в течение 24 часов в четвертую и пятую лунки.
Выполняйте микроскопическую визуализацию в режиме покадровой съемки с одним кадром каждые 15 минут, используя проходящий свет и источник возбуждающего света для флуоресцентного репортера, и запустите микрофлюидную программу. Откройте программное обеспечение ImageJ или Fiji на компьютере и перетащите изображения покадровой микроскопии Hyperstack на панель загрузки Fiji. Используйте «Изображение», затем «Цвет», а затем «Создать композит», чтобы объединить различные каналы гиперстека.
Используйте «Изображение», «Цвет», а затем «Упорядочить каналы», если каналы не соответствуют нужному цвету. Откройте плагин MicrobeJ и обнаружите бактериальные клетки с помощью интерфейса ручного редактирования. Удалите автоматически обнаруженные ячейки и вручную обведите интересующие ячейки-сохранятели кадр за кадром.
После обнаружения используйте значок «Результат» в интерфейсе ручного редактирования MicrobeJ, чтобы создать таблицу ResultJ. Используйте таблицу ResultJ для получения аналитических сведений о различных параметрах, представляющих интерес для анализа одной ячейки, и сохраните файл ResultJ. МПК офлоксацина для обоих штаммов был определен как 0,06 мкг на миллилитр, что указывает на то, что слияние hupA-mCherry не влияло на чувствительность офлоксацина по сравнению с изогенным штаммом дикого типа.
Точечный анализ показал изолированные клоны при соответствующих разведениях с течением времени, например, от 10 до отрицательного пятого разведения в нулевое время. В анализе времени наблюдалась типичная двухфазная кривая, где первый наклон отражает быстрое уничтожение популяции, не сохраняющей персистенции. Вторая фаза показала более медленную скорость убийства, выявив наличие устойчивых к лекарствам персистентных клеток.
Примечательно, что кривая убийства времени показывает, что слитый белок hupA-mCherry не влияет на кинетику убийства по времени. В микрофлюидном эксперименте первая фаза роста указывает на то, что клетки были жизнеспособными и делились до лечения офлоксацином. После этой первой фазы роста деление клеток было заблокировано, как только антибиотик достиг клеток.
После лечения офлоксацином, при перфузии свежей средой, подавляющее большинство клеток не смогли возобновить рост. Напротив, небольшая субпопуляция может удлиняться и генерировать нитевидные клетки, которые определяются как персистентные клетки. Делящаяся персистентная нить генерировала несколько дочерних клеток, большинство из которых начали расти и делиться аналогично необработанным клеткам.
Увеличение длины клеток коррелировало с увеличением общей интенсивности флуоресценции mCherry, что отражает перезапуск репликации и увеличение численности нуклеоидов. При использовании штамма, содержащего внутриклеточный репортер, для изучения персистенции, императивно, что присутствие репортера не мешает росту, MIC и убийству по сравнению со штаммом дикого типа. Процедура, описанная здесь, может быть применена к другим условиям и видам бактерий для мониторинга клеточных реакций на изменяющуюся среду или стрессы.
Используя другие флуоресцентные репортеры в идентичной установке, можно по-новому взглянуть на физиологию персистентных клеток.
