Este protocolo implica probar la eficacia antibacteriana en tiempo real de los antibióticos eluidos de un dispositivo polimérico, lo que puede ayudar a determinar con precisión las formulaciones efectivas que aumentan su valor de traducción. Este método permite la capacidad de prueba de eficacia antibacteriana en tiempo real para monitorear la actividad longitudinal de los materiales liberadores de fármacos y comprender el rango de actividad antibacteriana para una formulación de implante dada. Este material polimérico se utiliza en más del 90% de los reemplazos totales de juntas como superficie de apoyo.
Y estas formulaciones liberadoras de antibióticos se desarrollan como posibles tratamientos para las infecciones articulares periprotésicas. Este método se puede utilizar con cualquier dispositivo liberador de fármacos, como metales porosos, polímeros degradables y no degradables, geles y posiblemente materiales particulados con modificaciones de protocolo específicas del material. Para comenzar, cultive las bacterias durante la noche en un mililitro de caldo de soja tríptico.
Luego diluya la suspensión bacteriana cultivada durante la noche en caldo estéril Mueller Hinton, o MHB, y verifique el recuento bacteriano viable utilizando las unidades de luminiscencia antes del inicio del experimento como se describe en el manuscrito. Coloque las tiras UHMWPE vírgenes y cargadas de drogas dentro de una jeringa de tres mililitros. Luego extraiga la suspensión bacteriana que contiene MHB en la jeringa a través de la aguja adjunta hasta la marca de 1.5 mililitros.
Coloque la configuración de la jeringa en una incubadora de agitación hasta los puntos de tiempo indicados de seis horas, y luego todos los días hasta el día siete. Después de cada punto de tiempo indicado, saque la configuración de la jeringa y dispense el medio en un tubo de dos mililitros. Realice un ensayo de viabilidad microbiana en tiempo real como se describe en el manuscrito utilizando 100 microlitros de suspensión bacteriana.
Después de determinar el recuento de bacterias viables, calcule las unidades formadoras de colonias por mililitro a partir de las unidades de luminiscencia utilizando la curva estándar correspondiente. Para verificar la ausencia de bacterias viables en las muestras que mostraron valores de luminiscencia por debajo del límite de detección, se extendió el cultivo en placas trípticas de agar soja. Incubar las placas a 35 grados centígrados durante la noche.
Luego verifique la presencia de colonias al día siguiente. Centrifugar la suspensión bacteriana restante. Aspire suavemente el medio gastado.
Deje 100 microlitros de sobrenadante en los tubos con pellets invisibles. Resuspender las bacterias peletizadas en MHB fresco. Vórtice durante 10 segundos para asegurar una resuspensión completa.
Luego extraiga la suspensión bacteriana en la misma configuración de jeringa a través de la aguja conectada. Comience recuperando superficies UHMWPE vírgenes y cargadas de drogas de la configuración de la jeringa después de completar el estudio el séptimo día. Luego transfiera las superficies a tubos de 1.5 mililitros y enjuague con un mililitro de PBS estéril tres veces.
Sonicar la superficie durante 40 minutos en un mililitro de PBS estéril. Determinar la viabilidad de las bacterias adherentes mediante la realización de un ensayo de luminiscencia en 100 microlitros de la muestra sonicada. La liberación del fármaco de la vancomicina y la UHMWPE cargada con gentamicina demostró una liberación de ráfaga a las seis horas, seguida de una tasa de liberación constante con una concentración mayor que la concentración inhibitoria mínima hasta los siete días.
UHMWPE con vancomicina y gentamicina demostró una reducción de más de tres logaritmos para ATCC 12600 susceptible a partir de las seis horas y se observó una erradicación completa en el tercer día. Para la cepa L1163 susceptible a la gentamicina y la vencomicina, ambos materiales liberadores de fármacos causaron una reducción de más de tres logaritmos a las seis horas y no se observó crecimiento de colonias el primer día. La elución de gentamicina de UHMWPE no afectó la viabilidad bacteriana de la cepa intermedia L1101 resistente a la gentamicina y a la vancomicina.
Por el contrario, la elución de vancomicina de UHMWPE redujo significativamente la viabilidad bacteriana a las seis horas. Las superficies de gentamicina y UHMWPE liberador de vancomicina no mostraron bacterias adherentes viables cuando se expusieron a cepas de resistencia susceptibles e intermedias después del día siete. Sin embargo, algunas bacterias viables estaban presentes en UHMWPE liberador de gentamicina expuesto a L1101 resistente a la gentamicina.
La superficie de control de polietileno virgen mostró bacterias adherentes viables cuando se expuso a cada cepa. La separación de los medios gastados en cada punto de tiempo que facilita el arrastre de la población microbiana es crucial para simular la exposición sostenida a los antibióticos. Si bien es una mejora en los métodos estáticos, este método de simulación semiestática se puede seguir con una configuración continua para comprender mejor la cinética de actividad de las nuevas formulaciones de medicamentos contra las infecciones.
El protocolo nos ha permitido capturar el efecto de la elución del fármaco en la dinámica bacteriana dependiente de la cepa. Mejora las herramientas para la evaluación de la eficacia de los dispositivos de administración sostenida de antibióticos.
