Для начала положите бритую мышь под наркозом на грелку. Сожмите кожу пинцетом возле четвертого соска и разрежьте приподнятую кожу острыми ножницами, чтобы сделать разрез по средней линии примерно в один сантиметр. Сделайте круговые разрезы вокруг железы как в краниальном, так и в каудальном направлениях, и осторожно отшелушите кожу от живота.
Немедленно удалите любую экзогенную кровь физиологическим раствором, чтобы избежать последующей потери оптического разрешения. Чтобы свести к минимуму кровопотерю, запечатайте все выступающие кровеносные сосуды с помощью ручного прижигания. Затем аккуратно подразните поверхностный слой тонкими щипцами, чтобы удалить поверхностную соединительную и жировую ткань.
Поддерживайте открытую железу влажной с помощью физиологического раствора. При необходимости обработайте железу экзогенными средствами, например, фармакологическими средствами или органеллами-специфическими красителями, промыв открытые железы во время операции. Защитите брюшную стенку полупрозрачной эластичной термопластичной пленкой.
Осторожно расположите мышь брюшной стороной вниз на перевернутом предметном столике микроскопа таким образом, чтобы кожный лоскут выходил на центральное покровное стекло. Открытые участки защитите тонким слоем геля. Прикрепите заднюю ногу и хвост к сцене скотчем.
Затем поместите изготовленную на заказ прокладку, изготовленную из трех приклеенных ватных палочек, между кожным лоскутом и стенкой тела, чтобы смягчить железу от артефактов движения, вызванных дыханием и сердцебиением. Надежно заклейте пластиковую крышку с обоих концов отверстия сцены, чтобы кожный лоскут не скользил во время визуализации. Введите подкожный постоянный катетер под тыльную сторону кожи, прикрепленный к трубке, шприцу и насосу.
С помощью обычной флуоресцентной микроскопии подтвердите, что кожный лоскут стабилен с адекватным кровотоком. Проведите обычную конфокальную микроскопию мыши с мембраной EGFP cyto или EGFP, меченной BODIPY 665676, и двухфотонную микроскопию мыши-мембраны EGFP, меченной монодансилпентаном, и мыши-мембраны tdTomato, меченной монодансилпентаном. У мышей с EGFP цитоплазма секреторных эпителиальных клеток была отчетливо помечена EGFP.
В то же время липидные капли, окрашенные BODIPY 665676, проявлялись в виде круглых флуоресцентных тел, особенно по направлению к апикальной поверхности. Покадровый анализ показал, что окрашенные липидные капли BODIPY 665676 перемещаются из базальной области в апикальную с переменной скоростью и сливаются друг с другом при прохождении. У мембранных мышей EGFP EGFP выделял плазматические мембраны капиллярных и секреторных эпителиальных клеток, а окрашенные BODIPY капли липидов были видны по всей цитоплазме.
Двухфотонная микроскопия молочных желез мышей с мембраной EGFP или мембраной tdTomato позволила провести более полное исследование морфологии желез. Коллагеновые волокна на поверхности визуализируются в канале монодансилпентана посредством генерации второй гармоники. Далее в паренхиму секреторный эпителий раскрывается с базальными, латеральными и апикальными плазматическими мембранами и каплями липидов, окрашенными монодансилпентаном.
Центральный просвет становится заметным дальше в альвеолу. Красный флуорофор tdTomato был особенно полезен для мечения эндотелия капилляров, в отличие от EGFP у цитомышей EGFP.
