Чтобы лучше понять состав и структуру сосудистого сплетения, эффективным методом выделения сосудистого сплетения из желудочков головного мозга является первый неоценимый шаг. С помощью этого метода микродиссекции можно рассечь сосудистое сплетение из желудочков головного мозга, сохраняя при этом его функцию, жизнеспособность и структуру, не загрязняя сосудистое сплетение окружающими тканями. Существенным препятствием в изоляции сосудистого сплетения является идентификация структуры, поскольку она все еще плавает в желудочках мозга.
Окрашивание сосудистого сплетения бромфеноловым синим облегчает изоляцию. Продемонстрирует процедуру Элиен Ван Вонтергем, руководитель нашей лаборатории. Начните с приготовления терминального анестетика, раствора транскардиальной перфузии и раствора, необходимого для сканирующей электронной микроскопии или СЭМ, а также других растворов, упомянутых в тексте.
Чтобы изолировать мозг мыши, поместите неизлечимо анестезированное животное в положение дорсального пролежня и зафиксируйте мышь, прижав конечности к тарелке. Продезинфицируйте грудную клетку, распылив 70% этанол, прежде чем сделать разрез примерно на четыре сантиметра прямо под диафрагмой с помощью хирургического лезвия из углеродистой стали. Вскрыть кожу и обнажить грудную клетку с помощью хирургических ножниц.
Разрежьте диафрагму полностью и отделите грудную клетку, чтобы обнажить легкие и бьющееся сердце. С помощью перфузионного насоса транскардиально перфузируйте мышь 10 миллилитрами перфузионного раствора со скоростью 4,5 миллилитра в минуту. Вставьте иглу 26-го калибра в левый желудочек, чтобы перекачать раствор в системный контур.
С помощью хирургических ножниц разрежьте правое предсердие, чтобы кровь вышла из кровообращения. После обезглавливания мышь разрезают кожу головы, сделав разрез, начиная между ушами и заканчивая глазами. Потяните кожу вбок, чтобы обнажить череп.
Затем разрежьте череп, проведя чешуйчатые швы по направлению к носовой части. После этого поместите мозг в ледяную чашку Петри и добавьте один миллилитр ледяного PBS в ткань мозга. Чтобы изолировать сосудистое сплетение, плавающее в четвертом желудочке, аккуратно отрежьте мозжечок от головного мозга с помощью скальпеля.
Удалите оставшиеся части ткани ствола мозга из мозжечка. Поверните мозг так, чтобы линия разреза была обращена вверх, убедившись, что полость четвертого желудочка видна в середине участка с сосудистым сплетением, лежащим на дорсальном участке. При необходимости вскрывают желудочек, вытягивая соединительную ткань острыми щипцами.
Аккуратно вырвите сосудистое сплетение из стенки желудочка с помощью крошечных острых щипцов. Чтобы изолировать сосудистое сплетение от бокового желудочка, сагиттально разрезают мозг на два полушария с помощью крошечных острых щипцов. Поверните одно полушарие мозга так, чтобы линия разреза была направлена вверх.
Чтобы раскрыть боковой желудочек, аккуратно оттяните кору от таламуса. Втяните гиппокамп к середине сагиттальной линии разреза. Боковой желудочек теперь виден с сосудистым сплетением, лежащим на дне желудочка.
При необходимости немного приоткройте желудочек, растянув соединительную ткань острыми щипцами. Используйте крошечные острые щипцы, чтобы аккуратно вырвать сосудистое сплетение из стенки желудочка. Чтобы выполнить пробоподготовку для СЭМ, перенесите свежеизолированное сосудистое сплетение в свежеприготовленный фиксирующий раствор и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия.
После этого промойте образец три раза, используя от трех до пяти миллилитров 0,1-молярного буфера какодилата натрия в течение пяти минут каждый. Постфиксируйте образцы в трех-пяти миллилитрах 2%-ного тетраоксида осмия в 0,1-молярном буфере какодилата натрия в течение 30 минут. Затем промойте образцы три раза по пять минут каждый, используя три-пять миллилитров сверхчистой воды.
Затем обезвоживают образцы в возрастающей серии концентраций ледяного этилового спирта в течение 15 минут на раствор этилового спирта. Используйте сушилку для критических точек, чтобы правильно высушить образец. Осторожно поместите образец на крепление для образца с помощью карбоновой наклейки и визуализируйте образцы сосудистого сплетения с помощью SEM.
Настоящий протокол способствовал эффективной изоляции сосудистого сплетения от бокового и четвертого желудочков мозга мыши. Перфузия бромфеноловым синим привела к визуализации сосудистого сплетения. Когда бромфенол синий не допускался на дальнейших стадиях обработки, перфузия PBS-гепарином или перфузия не проводилась для обработки.
Морфологический анализ поверхности эпителиальных клеток сосудистого сплетения, или CPE, ясно показывает структуру двух плеч четвертого желудочка и типичную С-образную форму латерального сосудистого сплетения, выделенного из бокового желудочка. Более высокое увеличение SEM выявило везикулоподобные структуры на апикальной стороне клеток CPE и микроворсинок, что указывает на то, что морфологические изменения клеток CPE в условиях заболевания могут быть исследованы с помощью SEM. Важно только трогать и вынимать ткань сосудистого сплетения, чтобы не загрязнить образец окружающими тканями.
Соблюдайте необходимую осторожность, чтобы сохранить структуру сосудистого сплетения. Различные последующие методы могут быть применены к изолированному сосудистому сплетению для исследования его структуры и функции, начиная от микроскопического анализа через транскриптомный анализ и проточную цитометрию. Микрорассечение сосудистого сплетения из мозга позволяет нам лучше понять структуру и функцию этой крошечной мозговой ткани.
Эти знания необходимы для лучшего понимания его роли в неврологических заболеваниях.
