Офтальмологические исследования в прежние времена в основном основывались на глазной ткани умерших людей. Однако за прошедшие годы было разработано множество офтальмологических моделей грызунов, и потребность в глазной ткани человека уменьшилась. Из-за небольшого размера и ограниченной площади операций в глазу грызуна эффективный доступ к подразделению глаза сильно ограничен.
Как правило, чтобы прооперировать глаз грызуна, глаз иммобилизуют через зрительный нерв и проводят рассечение. Эта практика трудна и может повредить хрупкую ткань, поскольку сферический глаз продолжает двигаться во время рассечения. Несмотря на то, что он полезен для изоляции различных участков слоев сетчатки, этот метод не может разграничить пространственную ориентацию ткани при рассечении ткани.
Кроме того, целенаправленное вмешательство трудно обнаружить после рассечения из-за однородной клеточной сборки задней и передней глазной чашечки. В этом видео демонстрируется модифицированный хирургический метод микродиссекции. Наличие прикрепленной мигательной мембраны, или третьего века, представляет собой уникальные и значительные преимущества.
В этом методе сначала глазное яблоко энуклеируется третьим веком, затем третье веко используется для иммобилизации глаза. Затем следует прокалывание глазного яблока через лимб роговицы, и разрез используется в качестве точки входа. Затем, разрезая по окружности, разделяют переднюю и заднюю наглазники.
При дальнейшем рассечении задней чашки глаза выявляется полупрозрачный слой нервной сетчатки и аккуратно отслаивается. Таким образом, нейронный слой и слой RPE получают для дальнейшей обработки. Третье веко позволит нам разграничить пространственную ориентацию глаза после энуклеации.
Давайте теперь выполним подробную пошаговую процедуру. Расширьте глаза грызунов с помощью капель 0,8% тропикамида и 5% офтальмологических растворов фенилэфрина и поместите животное в темное место на 30 минут перед процедурой. Усыпить животное путем внутрибрюшинного введения пятикратных доз анестезии.
Типичная доза составляет 200 микролитров PBS, содержащих 10 мг кетамина и один мг ксилазина. Подтвердите полное отсутствие реакции на раздражитель, изучив педальный рефлекс. Поместите мышь в боковое лежачее положение, чтобы обеспечить полный доступ к глазу.
Подготовьте к процедуре щипцы для наложения швов Colibri, изогнутые щипцы, микролезвие размером 15 градусов три миллиметра, пружинные микроножницы и угловые пружинные микроножницы. Поместите изогнутые щипцы вокруг глазного яблока и зажмите, чтобы освободить глаз от посторонних прикреплений. Третье веко, также известное как мигательная мембрана, расположено по направлению к верхнему углу касательной носа и может быть идентифицировано как незначительный полупрозрачный выступ с пигментированными границами.
Далее воспользуйтесь пружинными микроножницами и обрежьте вокруг глазного яблока. Небольшие, непрерывные разрезы освобождают глазное яблоко от склеральных прикреплений. Поместите изогнутые пружинные микроножницы под глазное яблоко, чтобы освободить глаз, разрезав зрительный нерв.
Поместите энуклеированный глаз в чашку Петри, содержащую буфер PBS, таким образом, чтобы глазное яблоко было погружено в PBS. Некоторые экстраокулярные мышцы или ткани начнут отплывать от глазного яблока. Удалите их, отрезав от глазного яблока с помощью пружинных микроножниц.
Затем удалите зрительный нерв от основания глазного яблока, чтобы обеспечить лучшее разделение сетчатки для целых препаратов. Нет необходимости удалять зрительный нерв для рассечения тканей. Перенесите глазное яблоко в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую один мл 4% параформальдегида или PFA.
Держите его в течение двух часов при четырех градусах Цельсия для фиксации тканей. На этом этапе можно сделать паузу, оставив ткань в PFA на срок до 12 часов при четырех градусах Цельсия. Однако для выделения живых клеток этапы фиксации не следует выполнять, и вся процедура должна выполняться в континууме.
После фиксации PFA перенесите глазное яблоко в чашку Петри, содержащую PBS, и поместите ее под препарирующий микроскоп для выполнения последующей процедуры. Обездвижьте глазное яблоко, крепко удерживая третье веко щипцами для наложения швов Colibri. Лимб - это склеральное соединение роговицы.
Сделайте небольшой разрез на лимбе, проткнув его с помощью микролезвия. Разрез делается желательно напротив третьего века. Затем, используя этот разрез в качестве отправной точки, микроножницами сделайте небольшие и непрерывные надрезы вдоль окружности лимба склеры роговицы.
Сначала сделайте полукруг разрезов, начиная с точки разреза до третьего века. Затем завершите оставшийся полукруг надрезов с другой стороны. Наконец, сделайте разрез вокруг третьего века, чтобы разделить заднюю и переднюю чашечку.
Извлеките хрусталик из задней чашки с помощью щипцов, чтобы получить заднюю чашку, состоящую из невральной сетчатки и слоя RPE, а также передней чашки роговицы. При работе с нефиксированными тканями передняя и задняя чашечки теперь могут ферментативно перевариваться для получения одноклеточной суспензии роговицы или сетчатки. Для фиксации тканей перенесите эти чашки в тюбик объемом 1,5 мл, содержащий 1 мл 4% PFA, в течение 12 часов при четырех градусах Цельсия.
После фиксации ткань может быть помещена в соответствующую среду, и криосекция или парафиновое сечение могут быть выполнены для получения срезов роговицы или сетчатки. Снова введите заднюю чашку в чашку Петри, содержащую буфер PBS. Непрозрачный слой на пигментированном слое RPE представляет собой нервную сетчатку.
Отклеить нервную сетчатку с помощью вторых щипцов. Настоятельно рекомендуется очень мягкое и легкое движение руки, чтобы не повредить ткани. На выходе зрительного нерва изогнутые пружинные ножницы могут быть вставлены под нервную сетчатку, и можно сделать разрез, чтобы полностью освободить слои, если нервная сетчатка остается прикрепленной.
Сетчатку также можно освободить или отсоединить, нежно поглаживая ее мягкой щеткой. Повторно вводят переднюю и заднюю чашки в чашку Петри, содержащую буфер PBS. Используйте угловые пружинные микроножницы, чтобы сделать разрез рядом с третьим веком от периферии перпендикулярно к зрительному центру.
Удерживайте третье веко и сделайте разрез рядом с первым срезом. Сделайте аналогичный разрез между вторым срезом и третьим веком. Три или четыре таких равноудаленных среза открывают полушаровидные чашечки в форме цветка, который падает плашмя и может быть легко установлен.
Не делайте очень глубоких надрезов до центра чашки, так как это может привести к тому, что срезы листьев легко развалятся или отделятся. Жидкая среда позволяет передней чашке глаза приобретать изогнутую структуру. Выполните те же действия, что и для разрезов на задней чашке, чтобы сделать три или четыре равноудаленных надреза на передней чашке.
Теперь ткани готовы к дальнейшему окрашиванию. На этом рисунке показано все крепление передней чашечки. Ткань роговицы была микрорассечена, как описано, чтобы выявить лимфатические сосуды в прикрепленной конъюнктивальной ткани листка роговицы.
На этом рисунке показана вся горсть нервной сетчатки. Сосудистая сеть нервной сетчатки была окрашена изолектином и видна в виде зеленых сосудов. В этом методе энуклеированное глазное яблоко мышей получают с прикрепленным третьим веком для эффективного и легкого обращения.
Третье веко полностью обездвиживает глазное яблоко и позволяет проводить вскрытие с легкостью и минимальными ошибками. Этот метод полезен для секционирования тканей глаза, анализа отдельных клеток и целых маунтов. Однако необходимость повторяющейся фиксации ткани делает ткань нежизнеспособной для культивирования клеток или таких потребностей в живых клетках.
Следовательно, процедура должна выполняться в континууме для выделения живых клеток.
